Clonación molecular mediante la reacción en cadena de la polimerasa, una guía educativa para la ingeniería celular

Elegir las enzimas de restricción adecuadas en función de criterios definidos

Para proceder con un ejemplo conciso, se clonó la proteína fluorescente tdTomato en un vector alfaretroviral. Consecutivamente, se generó una línea celular de leucemia murina que expresa tdTomato. Esta línea celular se utilizará para rastrear las células tumorales tras su inyección en ratones en estudios preclínicos de inmunoterapia. Sin embargo, este método de clonación es aplicable a cualquier otro gen. Para comenzar el proyecto de clonación, hay que analizar el gen de interés (GOI). En primer lugar, comprobamos si nuestra secuencia anotada tiene un codón de inicio (ATG, el codón de inicio más común) y uno de los tres codones de parada (TAA, TAG, TGA). En caso de que el gen haya sido previamente manipulado o fusionado con otro gen (por ejemplo, a través de una secuencia 2A), ocurre que un gen de interés podría no tener un codón de parada. En estos casos, es necesario añadir un codón de parada al final de su secuencia anotada. También es beneficioso investigar si su GOI contiene un marco de lectura abierto (ORF). Esto es importante, ya que la manipulación frecuente de las secuencias, ya sea mediante software o a través de la clonación, podría añadir o eliminar nucleótidos por error. Utilizamos el software Clone Manager (SciEd) para encontrar ORFs en nuestras secuencias de plásmidos; sin embargo, hay varios sitios web gratuitos que puede utilizar para encontrar ORFs, incluyendo el buscador de marcos de lectura abiertos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).

El gen tdTomato contiene el codón de inicio ATG y el codón de parada TAA (Figura 1). El tamaño del gen tdTomato es de 716 pb.

Resumen del inicio y el final del gen de interés. (A) Se muestran las secuencias de nucleótidos al inicio y al final del gen tdTomato. Los nucleótidos de la cadena codificante se especifican en negrita. (B) Se muestran las secuencias de nucleótidos de los cebadores directo e inverso que contienen sitios adecuados de enzimas de restricción y la secuencia Kozak.

En un siguiente paso, es necesario diseñar cebadores de PCR que incluyan sitios adecuados de enzimas de restricción para la amplificación del GOI. Hay que tener en cuenta varios criterios para elegir las enzimas de restricción óptimas. En primer lugar, los sitios de unión para las enzimas de restricción deben estar disponibles idealmente en un sitio de clonación múltiple dentro del vector. Como alternativa, pueden situarse aguas abajo del promotor en la secuencia del vector. Las enzimas de restricción deben ser de corte simple (las de corte simple se dirigen a un solo sitio de restricción dentro de una secuencia de ADN) (Figura 2A). Si son de corte doble o múltiple, deben cortar dentro de una secuencia que no es necesaria para el correcto funcionamiento del plásmido vectorial y finalmente serán eliminadas (Figura 2B). También es posible elegir una enzima de corte doble o múltiple que corte el vector aguas abajo del promotor y tampoco dentro de una secuencia vital del plásmido (Figura 2C). Las enzimas de corte doble o múltiple tienen dos o más sitios de restricción en una secuencia de ADN, respectivamente. El corte del vector con cortadores dobles o múltiples daría lugar a dos extremos idénticos. En tal caso, el casete de inserción también debería contener los mismos sitios de enzimas de restricción en ambos extremos. Por lo tanto, cuando los fragmentos del inserto y del vector se mezclan en un experimento de ligación, el inserto puede fusionarse con el vector en la orientación correcta (del codón de inicio al codón de parada) o inversa (del codón de parada al codón de inicio). Puede darse un tercer escenario, si el fragmento del vector forma un círculo de autoligado omitiendo el inserto en absoluto. Una vez incubado el ADN con las enzimas de restricción, la desfosforilación de los extremos 5′ y 3′ del plásmido vectorial mediante una enzima fosfatasa alcalina reducirá en gran medida el riesgo de autoligado. Por lo tanto, es importante examinar un producto de clonación en busca de esos tres productos (orientación correcta, orientación inversa, autoligado) después de la ligación del fragmento.

Elección de las enzimas de restricción adecuadas en función de criterios definidos para la clonación por PCR. (A) Dos enzimas de restricción de corte simple (E1 y E2) se sitúan aguas abajo del promotor. (B) Las enzimas de restricción E1 y E2 cortan el plásmido aguas abajo del promotor varias veces (aquí dos veces para cada enzima). (C) La enzima de restricción E1 corta el plásmido aguas abajo del promotor más de una vez. (D) El producto de la PCR, que contiene el gen tdTomato y los sitios de la enzima de restricción, se corrió en un gel antes de ser extraído para las aplicaciones posteriores.

En segundo lugar, debido a la mayor eficiencia de clonación utilizando fragmentos de ADN de extremo pegajoso, es deseable que al menos una (mejor ambas) de las enzimas de restricción sea un llamado cortador de extremo pegajoso. Los cortadores de extremos pegajosos cortan el ADN asimétricamente generando extremos cohesivos complementarios. En cambio, los cortadores de extremos romos cortan la secuencia de forma simétrica sin dejar salientes. La clonación de fragmentos de extremo romo es más difícil. No obstante, la elección de una mayor relación molar inserto/vector (5 o más) y el uso de un 10% de polietilenglicol (PEG) pueden mejorar la ligación de los fragmentos de extremo romo.

En tercer lugar, algunas enzimas de restricción no cortan el ADN metilado. La mayoría de las cepas de E. coli contienen metilasas Dam o Dcm que metilan las secuencias de ADN. Esto las hace resistentes a las enzimas de restricción sensibles a la metilación. Dado que el ADN del vector se prepara principalmente en E. coli, estará metilado. Por lo tanto, es deseable evitar las enzimas de restricción sensibles a la metilación; sin embargo, a veces el isosquizómero de una enzima de restricción sensible a la metilación es resistente a la metilación. Por ejemplo, la enzima Acc65I es sensible mientras que su isosquímero kpnI es resistente a la metilación. Los isosquizómeros son enzimas de restricción que reconocen las mismas secuencias de nucleótidos. Si no queda más remedio que utilizar enzimas de restricción sensibles a la metilación, el ADN del vector debe prepararse en cepas dam – dcm – E. coli. En la Tabla 1 se resume una lista de estas cepas y también de las cepas huésped de E. coli más comunes para la clonación molecular. La información relativa a la sensibilidad a la metilación de las enzimas de restricción suele ser proporcionada por el fabricante.

En cuarto lugar, facilita la clonación si el tampón necesario para la plena funcionalidad de las enzimas de restricción es el mismo porque se puede realizar una doble digestión de restricción. Esto ahorra tiempo y reduce la pérdida de ADN durante la purificación. Puede ocurrir que una de las enzimas de restricción sea activa en un tampón y la segunda enzima sea activa en el doble de concentración del mismo tampón. Por ejemplo, la enzima NheI de Thermo Scientific es activa en el tampón Tango 1X (Thermo Scientific) y la enzima EcoR1 es activa en el tampón Tango 2X (Thermo Scientific). En estos casos, el ADN del plásmido debe ser digerido primero por la enzima que requiere la mayor concentración de tampón (en este caso EcoR1). A continuación, se diluye el tampón para la siguiente enzima (que requiere una concentración menor (aquí NheI)) en el mismo tampón. Sin embargo, la aparición de tampones universales ha simplificado la doble digestión de las secuencias de ADN. En nuestro ejemplo, el vector contiene los sitios de restricción AgeI y SalI. Estos sitios enzimáticos se utilizaron para diseñar los cebadores de la PCR (Figura 1). Para que la digestión con enzimas de restricción sea correcta, es esencial que la pureza del plásmido sea alta. La absorbencia del ADN, medida con un espectrofotómetro, puede utilizarse para determinar la pureza tras la purificación. El ADN, las proteínas y los disolventes se absorben a 260 nm, 280 nm y 230 nm, respectivamente. Una relación OD 260/280 de >1,8 y una relación OD 260/230 de 2 a 2,2 se considera pura para las muestras de ADN. Las relaciones de DO 260/280 y 260/230 de nuestras preparaciones de plásmidos ejemplares fueron de 1,89 y 2,22, respectivamente. Observamos que la pureza de los fragmentos de vector e inserto de ADN extraídos del gel era menor después de la digestión de restricción; la ligación funciona incluso en tales casos, sin embargo, se pueden esperar mejores resultados utilizando fragmentos de alta pureza.

El siguiente sitio web de repositorios de plásmidos puede ser útil para la selección de diferentes vectores (expresión y empaquetamiento viral, backbones vacíos, proteínas fluorescentes, vectores inducibles, etiquetas epitópicas, proteínas de fusión, genes reporteros, sistemas de expresión de especies específicas, marcadores de selección, promotores, expresión de ARNhc e ingeniería del genoma):http://www.addgene.org/browse/.

Una colección de vectores de clonación de E. coli está disponible en el siguiente sitio web:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.

Diseño de cebadores de clonación basados en criterios definidos

Para el diseño de cebadores de PCR, compruebe los codones de inicio y parada de su GOI. Encuentre la secuencia de las enzimas de restricción deseadas (disponibles en los sitios web de los fabricantes) para el cebador delantero (Figura 3A). Debe situarse antes del GOI (Figura 1B). La llamada secuencia Kozak se encuentra en los ARNm eucariotas y mejora la iniciación de la traducción. Es beneficioso añadir la secuencia Kozak (GCCACC) antes del codón de inicio ATG, ya que aumenta la traducción y la expresión de la proteína de interés en eucariotas. Por lo tanto, insertamos GCCACC inmediatamente después de la secuencia de la enzima de restricción AgeI y antes del codón de inicio ATG. A continuación, los primeros 18 a 30 nucleótidos del GOI a partir del codón de inicio ATG se añaden a la secuencia del cebador forward. Estos nucleótidos superpuestos que se unen al ADN molde determinan la temperatura de recocido (Tm). Esta última suele ser superior a 60°C. Aquí utilizamos la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (Thermo Scientific). Puede utilizar los siguientes sitios web para determinar la Tm óptima:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.

Diseño de cebadores basados en criterios definidos para la clonación por PCR. (A-B) Se representan las secuencias del cebador directo y del inverso. El final de la cadena codificante debe convertirse en el formato de complemento inverso para el diseño del cebador inverso. Para más información, consulte el texto.

https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.

La Tm de nuestro cebador delantero es de 66°C.

Elija los últimos 18 a 30 nucleótidos, incluido el codón de parada de su GOI, para diseñar el cebador inverso (Figura 3B). A continuación, calcule la Tm de esta secuencia, que debe estar por encima de 60°C y cerca de la Tm del cebador directo. La Tm de la secuencia superpuesta de nuestro cebador inverso era de 68°C. A continuación, añada la secuencia objetivo del segundo sitio de la enzima de restricción (en este caso SalI) inmediatamente después del codón de parada. Por último, convierta esta secuencia ensamblada en una secuencia de complemento inverso. Las siguientes páginas web pueden utilizarse para determinar la secuencia del cebador inverso:

http://reverse-complement.com/

http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis es importante ya que el cebador inverso se une a la cadena codificante y, por lo tanto, su secuencia (5′ → 3′) debe ser complementaria inversa a la secuencia de la cadena codificante (Figura 1A).

Realización de la PCR utilizando polimerasas de corrección

Dado que la reacción de PCR sigue una amplificación logarítmica de la secuencia diana, cualquier error de replicación durante este proceso será amplificado. La tasa de error de las polimerasas de ADN sin corrección, como la polimerasa Taq, es de aproximadamente 8 × 10-6 errores/puntos por ciclo de PCR; sin embargo, las enzimas con corrección, como la polimerasa Phusion, tienen una tasa de error de 4,4 × 10-7 errores/puntos por ciclo de PCR. Debido a su mayor fidelidad y procesabilidad, en este ejemplo se utilizó la polimerasa de ADN Phusion. Hay que tener en cuenta que la Phusion tiene unos requisitos de temperatura diferentes a los de otras ADN polimerasas. La Tm del cebador para la Phusion se calcula basándose en el método de Breslauer y es más alta que la Tm de las polimerasas Taq o pfu. Para obtener resultados óptimos, la Tm debe calcularse basándose en la información que se encuentra en el sitio web de los proveedores de la enzima. Además, debido a la mayor velocidad de la Phusion, entre 15 y 30 segundos suelen ser suficientes para la amplificación de cada kb de la secuencia de interés.

Después de la PCR, es necesario cargar el producto en un gel (Figura 2D). Es necesario cortar la banda correspondiente y extraer el ADN. Es esencial secuenciar el producto de la PCR, ya que éste puede incluir mutaciones. Hay varios kits de clonación por PCR disponibles, algunos de los cuales se muestran en la Tabla 2. Nosotros utilizamos el vector de clonación pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, publicación de patente: US 2009/0042249 A1, número de acceso al Genbank EF694056.1) y clonamos el producto de la PCR en el vector linealizado. Este vector contiene un gen letal (eco47IR) que se activa en caso de que el vector se circularice. Sin embargo, si el producto de la PCR se clona en el sitio de clonación dentro del gen letal, éste se interrumpe permitiendo que las bacterias crezcan en colonias tras la transformación. Los vectores circularizados que no contienen el producto PCR expresan el gen tóxico, que por tanto mata a las bacterias impidiendo la formación de colonias. A continuación, se cultivan los clones bacterianos, se aísla consecutivamente el ADN del plásmido y se secuencian. La calidad del plásmido aislado es esencial para obtener resultados óptimos en la secuenciación. Aislamos el ADN plasmídico de un total de 1,5 ml de bacterias cultivadas (rendimiento de 6 μg de ADN; DO 260/280 = 1,86; DO 260/230 = 2,17) utilizando un kit de minipreparación de plásmidos (QIAGEN). Todo el proceso de la PCR, incluida la clonación del producto de la PCR en el vector de secuenciación y la transfección de las bacterias con el vector de secuenciación, puede realizarse en un día. Al día siguiente, los clones bacterianos se cultivarán durante la noche antes de ser enviados para su secuenciación.

Análisis de los datos de secuenciación

Las empresas de secuenciación normalmente informan de los datos de secuenciación como un archivo FASTA y también como secuencias de nucleótidos listas por correo electrónico. Para el análisis de la secuencia, se pueden utilizar los siguientes sitios web:

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi

Aquí nos centraremos en el primer sitio web. En esta página web, haga clic en la opción «nucleotide blast» (Figura 4A). Se abre una nueva ventana. Por defecto, la opción «blastn» (blast de secuencias de nucleótidos) está marcada (Figura 4B). A continuación, marque la casilla situada detrás de «Alinear dos o más secuencias». Ahora aparecerán dos cuadros. En la casilla «Enter Query Sequence» (la casilla superior), inserte la secuencia deseada de su gen de interés, que está flanqueada por los sitios de restricción que ya ha diseñado para sus cebadores de PCR. En la casilla «Enter Subject Sequence» (la casilla inferior), introduzca la secuencia o cargue el archivo FASTA que ha recibido de la empresa de secuenciación. A continuación, haga clic en el botón «BLAST» de la parte inferior de la página. Tras un par de segundos, los resultados se mostrarán en otra página. En la Figura 4C se muestra una parte de los datos del alineamiento. Para la interpretación, hay que tener en cuenta los siguientes puntos: 1) el número de nucleótidos idénticos (mostrados en el punto «Identidades») debe ser igual al número de nucleótidos de su gen de interés. En nuestro ejemplo, el número de nucleótidos del gen tdTomato junto con los de los sitios de enzimas de restricción y la secuencia Kozak era de 735. Esto es igual al número reportado (Figura 4C). 2) La identidad de la secuencia (en el punto «Identidades») debe ser del 100%. En ocasiones, la identidad de la secuencia es del 100% pero el número de nucleótidos idénticos es inferior al esperado. Esto puede ocurrir si uno o más de los nucleótidos iniciales están ausentes. Recuerde que todas las tecnologías de secuenciación tienen una tasa de error. En el caso de la secuenciación Sanger, esta tasa de error oscila entre el 0,001% y el 1%. La sustitución, deleción o inserción de nucleótidos puede identificarse analizando los resultados de la secuenciación. Por lo tanto, si la identidad de la secuencia no alcanza el 100%, el plásmido debe ser resecuenciado para diferenciar los errores de la PCR de los simples errores de secuenciación. 3) No debe haber lagunas (en el punto «Gaps»). Si se producen lagunas, el plásmido debe volver a secuenciarse.

Análisis de la secuencia del producto de la PCR utilizando la plataforma NCBI BLAST. (A) En la página web de NCBI BLAST, se elige la opción «nucleotide blast» (marcada por la línea ovalada). (B) La opción «blastn» aparece por defecto (marcada por el círculo). La secuencia del gen de interés (flanqueada por los sitios de restricción tal y como se han diseñado previamente los cebadores de la PCR) y el producto de la PCR deben introducirse en las casillas «Enter Query Sequence» y «Enter Subject Sequence». Las secuencias también pueden cargarse como archivos FASTA. (C) Se muestra la alineación de los primeros 60 nucleótidos. Dos elementos importantes para el análisis de la secuencia están marcados con líneas ovaladas.

La longitud media de una lectura, o longitud de lectura, es de al menos 800 a 900 nucleótidos para la secuenciación Sanger. Para el vector pJET es necesario utilizar un cebador directo y otro inverso para secuenciar el gen completo. Estos cebadores normalmente pueden cubrir un gen de un tamaño de hasta 1800 pb. Si el tamaño de un gen es superior a 1800, debe diseñarse un cebador adicional por cada 800 nucleótidos extra. Dado que la llamada de bases fiable no comienza inmediatamente después del cebador, sino entre 45 y 55 nucleótidos después del cebador, el siguiente cebador de avance debe diseñarse para que comience después de unos 700 nucleótidos desde el comienzo del gen. Para diseñar estos cebadores se pueden utilizar diferentes sitios web, incluyendo los siguientes:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design

Al tener 735 pb de longitud, el tamaño del producto de la PCR en este ejemplo estaba bien dentro del rango de los cebadores de secuenciación de pJET.

Después de elegir el clon de secuencia verificada, los plásmidos vectoriales y de inserción fueron digeridos por las enzimas de restricción AgeI y SalI (Figura 5). A continuación se procedió a la purificación en gel y a la ligación de los fragmentos. La transformación de E. coli competente con la mezcla de ligación produjo varios clones que se analizaron mediante enzimas de restricción. Evaluamos ocho clones, todos los cuales contenían el inserto tdTomato (Figura 6). Es importante elegir clones que sean grandes. Los clones satélites podrían no tener la construcción correcta. Utilizamos un kit de minipreparación rápida de plásmidos (Zymo Research) para extraer el plásmido de 0,6 ml de suspensión bacteriana. El rendimiento y la pureza fueron satisfactorios para el cribado basado en enzimas de restricción (2,3 μg de ADN; DO 260/280 = 1,82; DO 260/230 = 1,41). Para la purificación del plásmido a gran escala, se utilizó un kit de maxipreparación (QIAGEN) para extraer el plásmido de 450 ml de cultivo bacteriano (rendimiento de 787 μg de ADN; DO 260/280 = 1,89; DO 260/230 = 2,22). El rendimiento esperado de un aislamiento del plásmido derivado de pBR322 a partir de 1,5 ml y 500 ml de cultivo bacteriano es de unos 2-5 μg y 500-4000 μg de ADN, respectivamente.

Mapas de vectores y plásmidos de inserción A) Ilustración del plásmido CloneJET que contiene el producto de PCR. La inserción del producto de la PCR en el sitio de clonación del plásmido interrumpe la integridad del gen tóxico eco47IR y permite el crecimiento de clones positivos al transgén. El plásmido se cortó con las enzimas AgeI y SalI generando dos fragmentos de 3 kb y 0,7 kb de tamaño. El fragmento de 0,7 kb (gen tdTomato) se utilizó como inserto para la clonación. (B) Ilustración del plásmido vectorial. El plásmido se cortó con las enzimas AgeI y SalI generando dos fragmentos de 4,9 kb y 0,7 kb de tamaño. El fragmento de 4,9 kb se utilizó como vector para la clonación. AMP: Gen de resistencia a la ampicilina; PRE: elemento regulador postranscripcional; MPSV: promotor del virus del sarcoma mieloproliferativo.

Control del plásmido final con enzimas de restricción. Se muestra la ilustración del plásmido final. Para el cribado, el plásmido se cortó con la enzima BsiwI generando dos fragmentos de 4,8 kb y 0,8 kb de tamaño. AMP: Gen de resistencia a la ampicilina; PRE: elemento regulador postranscripcional; MPSV: promotor del virus del sarcoma mieloproliferativo.

Algunos plásmidos tienden a recombinarse dentro del huésped bacteriano creando inserciones, deleciones y recombinaciones. En estos casos, puede ser útil utilizar una E. coli deficiente en recA (Tabla 1). Además, si el GOI es tóxico, la incubación de las bacterias a temperaturas más bajas (25-30°C) y el uso de cepas ABLE C o ABLE K podrían evitar el problema.

Producción viral y transducción de células diana

Para investigar la expresión in vitro del gen clonado, se transfectaron células HEK293T con plásmidos que codificaban el gen tdTomato, el alfaretroviral Gag/Pol y la envoltura de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVG). Estas células, derivadas del riñón embrionario humano, son fáciles de cultivar y transfectar. Por ello, se utilizan ampliamente en biotecnología y terapia génica para generar partículas virales. Las células HEK293T requieren ser divididas cada dos días utilizando un medio caliente. No deben alcanzar el 100% de confluencia para obtener resultados óptimos. Para tener una buena eficiencia de transfección, estas células deben cultivarse durante al menos una semana para tenerlas en fase logarítmica. La eficiencia de transfección fue del 22%, según se determinó en base a la expresión de tdTomato por microscopía de fluorescencia 24 horas después (Figura 7A-B). Para generar una línea celular de leucemia murina que expresara el gen tdTomato para estudios de inmunoterapia, se transdujeron células leucémicas C1498 con el virus recién cosechado (36 horas de transfección). Los estudios de imagen (Figura 7C) y el análisis de citometría de flujo (Figura 7D) cuatro días después de la transducción confirmaron la expresión de tdTomato en la mayoría de las células.

Evaluación de la expresión in vitro del gen clonado. (A, B) Se transfectaron células HEK293T con plásmidos Gag/Pol, VSVG y tdTomato. La expresión del gen tdTomato se evaluó mediante un microscopio de fluorescencia. Las imágenes fluorescentes se superpusieron a una imagen de campo claro para diferenciar las células transducidas positivamente. La eficacia de la transfección se determinó en función de la expresión de tdTomato tras 24 horas. Se utilizaron células HEK293T no transfectadas como controles (histograma azul). (C, D) La línea celular de leucemia murina C1498 fue transducida con virus fresco. Cuatro días después, se evaluó la expresión del transgén mediante microscopía de fluorescencia (C) y citometría de flujo (D). Las células C1498 no transducidas se utilizaron como controles (histograma azul). Las barras de escala representan 30 μm.