¿Qué tienen en común las minipreparaciones de ADN y los experimentos de inmunoprecipitación de proteínas? Comienzan de forma diferente, pero terminan con la misma etapa crítica: la elución. Pero, ¿qué es exactamente la elución y para qué sirve?
La terminología
Primero, empecemos con algo de terminología básica:
Elución – extraer un material de otro mediante el lavado con un disolvente.
El adsorbente – una fase sólida, que puede ser un gel de sílice en el caso de las minicolumnas de preparación, pero normalmente son perlas que pueden unirse covalentemente a anticuerpos u otras moléculas de ligando. «Fase sólida» no significa necesariamente una columna de pie; pueden ser perlas en un eppendorf que son fáciles de lavar.
Afinidad – una medida de la capacidad del absorbente para unirse a la molécula de elección (lo que está tratando de eluir). Cuanto mayor sea la afinidad de la fase sólida con la biomolécula de elección (BOC), más estrechamente se unirá la molécula a ella. Sin embargo, no se desea que la unión sea irreversible; esto haría imposible la elución.
Eluente – un disolvente que elimina la COB del absorbente.
Eluato – el disolvente que contiene la COB eliminada del adsorbente.
Preparación del material
Antes de la elución, es necesario absorber la molécula de elección mientras se elimina la contaminación. Este es un paso esencial, ya que la sabiduría convencional nos recuerda «basura adentro, basura afuera». Puede tener excelentes reactivos para la elución, pero si su muestra contiene demasiada cantidad del personal no relacionado (el término científico es «mugre»), obstruirá el material de adsorción. La saturación de la fase sólida impedirá que su COB se absorba y luego contaminará el eluato. Los pasos efectivos de lisis y limpieza son esenciales para el éxito de su experimento de elución.
Es importante determinar el volumen de su material de preabsorción. El volumen de lisado que pasa a través del medio de absorción no debería superar los 3 – 5 volúmenes de la columna. El gran volumen de lisado que pasa a través del absorbente aumenta el tiempo del experimento, así como la probabilidad de absorción de mugre. En muchos casos, vale la pena reducir el volumen inicial de lisado por filtración o fraccionamiento. Así, el volumen de lisado determina el tamaño de la columna.
La elección del material de adsorción depende de la composición química de su molécula de interés. La absorción de biomoléculas suele implicar una interacción más o menos específica entre el sustrato y la molécula. Por ejemplo, el ADN se absorbe en las minicolumnas debido a la interacción iónica entre los grupos de fosfato del ADN cargados negativamente y las partículas de sílice cargadas positivamente.
Las proteínas suelen adsorberse en sefarosa o en perlas magnéticas cubiertas de IgG.
Después de una aplicación inicial de lisado, en ningún momento su columna puede secarse. Esto «horneará su» molécula al absorbente y perturbará la integridad de la columna. Si no tiene tiempo para continuar el experimento, rellene la columna con un tampón compatible y detenga el flujo.
Lavado
El propósito del lavado de la fase sólida es eliminar un material no relacionado, dejando la molécula de interés en la columna. La separación selectiva se consigue a menudo utilizando un tampón con baja fuerza iónica (por ejemplo, baja concentración de sal). El volumen del tampón de lavado debe ser cercano a la cantidad del material inicial y ser de al menos 3-5 volúmenes de la columna.
Sin embargo, después de que varios volúmenes del tampón de lavado pasen por la columna, las contaminaciones serán lavadas y cualquier lavado adicional no mejorará la calidad de su preparación. Además, empezará a perder su material objetivo.
Elución
Imagen: Cromatograma que muestra el perfil de absorción UV del sobrenadante de Arabidopsis separado en Sephadex G-50 Superfino. Volumen del gel: 500 mL; longitud de la columna: 700 mm; diámetro de la columna: 30 mm; caudal del eluyente: 12 mL / hr; volumen de la fracción: 8,0 mL; número de fracciones: 95; volumen de muestra: 5 mL; temperatura de separación: 4 °C; tampón de elución: 20 mM Tris-HCl, 1 mM NaN3; pH 8,0. Crédito de la imagen: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chrom_SephG-50.tif
La elución en sí misma funciona porque se interrumpen los enlaces entre la columna y el sustrato (es decir, utilizando una sal alta o una temperatura alta del eluyente). La elución suele realizarse en un pequeño volumen de tampón compatible con el almacenamiento de la muestra y las aplicaciones posteriores.
La elución del ADN de la columna de minipreparación es el caso más sencillo: un volumen de tampón elimina casi todo el ADN. La concentración de ADN en el eluido es inversamente proporcional al tampón de elución utilizado: cuanto más tampón se utilice, menor será la concentración final de ADN. Sin embargo, incluso en este caso, la mayoría de los fabricantes recomiendan utilizar un volumen adicional para eliminar todo el ADN.
Para las columnas, la velocidad de elución es crítica. Una velocidad demasiado lenta aumentará las posibilidades de degradación de la molécula; demasiado rápida y no habrá resolución de fracciones.
Para las columnas de gran volumen, es necesario recoger las fracciones de eluido porque la molécula se distribuirá entre ellas. La primera fracción contendrá una mezcla de tampón de lavado y elución y una posible contaminación no eliminada por el tampón de lavado.
Puede monitorizar la DO para su tipo de molécula (260nm/280nm para el ADN) y hacer un blot para la concentración de su molécula específica en cada fracción. En el caso más simple, la distribución de su molécula seguirá una curva de campana simple, pero puede tener uno o más picos agudos.
En conclusión, conocer los parámetros básicos de su experimento (absorbente, tamaño de la columna, tampón de lavado, tampón de elución, velocidad de flujo, número de las fracciones) y los principios generales de la elución le permitirá configurar su elución con éxito.
Para más detalles, busque un artículo donde los otros científicos hicieron algo similar – idealmente la misma molécula, pero una similar servirá – y adapte a su condición.
Deja una respuesta