Trp53 nul og R270H mutant alleler har sammenlignelige virkninger i regulering af invasion, metastase og genekspression i musekolon tumorigenese

Missense og nul Trp53 mutationer fremmer musekolon tumor progression i CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK) mus

For at udvikle en musekolon-tumormodel, der er initieret af genfejl som dem, der ofte findes i humane kolon-tumorer, genererede vi sammensatte mutantmus, der bærer en floxed Apc-allel (Apcflox, 580S, forkortet A), der kunne inaktiveres ved Cre-rekombinasefunktion, og en floxed, latent onkogen allel af Kras (KrasLSL-G12D, forkortet K), der kunne aktiveres ved Cre-rekombination. Ved hjælp af CDX2P-CreERT2-transgenet og TAM-behandling til aktivering af Cre-funktionen i colon-epitelceller målrettede vi Apc- og Kras-allelerne i epitelet i det distale ileum, cecum og colon. Mens CDX2P-CreERT2 K-musene viser serrated og hyperplasisk kolonepithel , havde CDX2P-CreERT2AK (AK)-musene serrated og hyperplastisk kolonepithel og udviklede også i gennemsnit 13 adenomer, der varierede i størrelse fra 0,5 mm til 2 mm, da de humane endepunkter blev nået for musene 10-15 måneder efter TAM-behandling (Fig. 1a). Hos seks ud af 10 AK-mus fandt vi et eller to adenokarcinomer, der opstod i cecum. Af de i alt otte adenokarcinomer, der blev fundet i de 10 undersøgte AK-mus, invaderede syv tumorer ind i muscularis propria (MP) eller dybere, og fem nåede sub-serosa eller serosa (Fig. 1b, Tabel 1 og Supplerende Tabel 1). Da kun 8 ud af 131 observerede tumorer i AK-musene var invasive, indebærer resultaterne imidlertid, at yderligere somatiske defekter ud over Apc- og Kras-mutationer var nødvendige for udvikling af invasive tyktarmstumorer i AK-musene.

Missense og null Trp53-mutationer fremmer musekolon-tumorprogression i CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK)-mus. a Kaplan-Meier-overlevelseskurver for CDX2P-CreERT2AK (AK)-mus (n = 10, medianoverlevelse = 336 dage), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+)-mus (n = 16, medianoverlevelse = 166 dage), CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) mus (n = 16, medianoverlevelse = 97 dage) og CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) mus (n = 20, medianoverlevelse = 88 dage). TAM blev administreret dagligt i to dage, og tidspunkt nul repræsenterer den anden af disse dage. P-værdierne blev opnået ved log-rank-test i følgende sammenligninger: P = 1,4E-6 for AK vs. AKP270/+; P = 1,4E-7 for AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1,9E-8 for AKP270/fl vs. AKP270/+. b Procentdel af tyktarmstumorer med forskellige invasionsdybder fra AK-mus, AKP270/+-mus, AKPfl/fl-mus og AKP270/fl-mus. Data er fra flere læsioner pr. mus (n = 10-14 mus pr. gruppe). P-værdier baseret på Fisher Exact-test og Exact Poisson-test er vist i henholdsvis Tabel 1 og Supplerende tabel 1. Fejlstænger er standardfejl i forhold til gennemsnittet. A adenom, SM submucosa, SM muscularis propria, MP muscularis propria, SS subserosa, S serosa. c, d Hæmatoxylin- og eosinfarvning (H&E) af repræsentative invasive tumorer fra væv fra proximal colon (højre) og cecum (venstre) er vist for AKP270/fl-mus (c) og AKPfl/fl-mus (d). Tumorer i (c) og (d) blev indsamlet 3 måneder efter TAM-injektion. Billeder med høj forstørrelse er vist i de nederste paneler og er indrammet i de lavere forstørrede områder i de tilsvarende øverste paneler. De stiplede linjer angiver grænsen mellem muskulært lag og subserosa. Skalaer: 500 μm for billede med lav forstørrelse (øverste paneler); 100 μm for billeder med høj forstørrelse (nederste paneler)

Som nævnt ovenfor findes TP53-mutationer i omkring 60 % af menneskelige CRC’er og synes at blive udvalgt under adenom-carcinom-progression . Vi søgte at vurdere samarbejdet mellem Trp53-inaktivering med Apc- og Kras-mutationer i kolontumorprogression in vivo, samt at bestemme, om potentielle GOF-effekter af en Trp53 missense mutant allel kunne ses i modellen. Vi indførte en konstitutiv Trp53R270H-mutantallel (den murine ækvivalent til menneskelig R273H, benævnt P270) og/eller en betinget nulallel Trp53flox (benævnt Pfl) i AK-modellen. Der blev genereret mus med sammensatte genotyper, og deres forkortelser er som følger: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+-mus), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl-mus) og CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl-mus). Kohorter af voksne AKP270/+-, AKP270/fl- og AKPfl/fl-mus blev induceret for tyktarmstumorer via TAM-behandling, og deres sundhedstilstand blev overvåget. Sammenlignet med AK-mus (medianoverlevelse = 336 dage) havde AKP270/+-, AKP270/fl- og AKPfl/fl-musene alle en betydeligt forkortet levetid. AKP270/fl- og AKPfl/fl-musene havde en medianoverlevelse på henholdsvis 88 og 97 dage, og AKP270/+-musene havde en medianoverlevelse på 166 dage (fig. 1a). AKP270/+-musene havde signifikant længere overlevelse end AKP270/fl- og AKPfl/fl-musene (P < 0,0001 for hver sammenlignet med AKP270/+-musene), men der blev ikke set nogen statistisk signifikant overlevelsesforskel ved sammenligning af AKP270/fl- og AKPfl/fl-musene (Fig. 1a). Tilføjelsen af Trp53-mutation(er) (R270H eller nul) øgede signifikant den samlede tumorincidens i forhold til den, der blev set i AK-mus (P < 0,0001 for både AKPfl/fl og AKP270/fl, sammenlignet med AK-mus, Supplerende tabel 1 nederst til venstre). AKP-mus havde også flere kolon- og cecum-tumorer, der manifesterede invasive træk (7,3 og 8,9 invasive tumorer pr. mus for henholdsvis AKPfl/fl-mus og AKP270/fl-mus) sammenlignet med AK-mus (0,8 invasive tumorer pr. mus; Fig. 1b og Supplerende tabel 1 øverst til højre, P < 0,0001 for både AKPfl/fl vs. AK og AKP270/fl vs. AK sammenligninger).

Dybdegående analyse af væv fra musens cecum og colon, der blev opnået ved nekropsi, definerede den omfattende tumorbyrde i AKP270/+, AKPfl/fl og AKP270/fl musene, med læsioner, der varierede fra adenomer til adenokarcinomer i sen fase (Fig. 1b-d og Tabel 1). Alle de undersøgte AKP270/+-, AKPfl/fl- og AKP270/fl-mus bar mindst ét adenokarcinom (tumorer med submucosa eller dybere invasion). Der blev fundet tegn på invasion i glat muskulatur og i nogle tilfælde til serosa i både cecum- og proximale kolonregioner hos AKP270/fl- og AKPfl/fl-musene (henholdsvis Fig. 1c, d). AKP270/+-musene, hvor Cre-targeted epitelceller oprindeligt bevarer én funktionel wild-type Trp53-allel, havde en længere latensperiode for tumorudvikling og den samlede tumorbyrde (18,5 pr. mus) og procentdelene af tumorer med dybere invasion (11.9 %) var signifikant lavere sammenlignet med AKP270/fl- eller AKPfl/fl-mus (Supplerende tabel 1 og tabel 1, P < 0,01 sammenlignet med AKP270/fl- eller AKPfl/fl-mus for tumorbyrde pr. mus og procenter af adenokarcinomer). Disse resultater understøtter forestillingen om, at wild-type p53 har en tumorsuppressorfunktion i kolon-tumorigenese, selv i forbindelse med en Trp53 missense mutant allel. Da alle de observerede tumorer blev sammenlignet mellem AKP270/fl- og AKPfl/fl-mus, fandt vi, at andelen af adenocarcinomer med submucosa- eller dybere invasion var højere hos AKP270/fl-mus end hos AKPfl/fl-mus (36,9 % og 26,1 % for henholdsvis AKP270/fl- og AKPfl/fl-mus; Tabel 1, P = 0,0026), hvilket tyder på en mulig beskeden GOF-effekt for R270H Trp53-allelen med hensyn til at øge vævsinvasion. Den beskedne stigning i invasivt potentiale i AKP270/fl-mus kan imidlertid blive opvejet, fordi den gennemsnitlige tumorbyrde pr. mus havde en tendens til at være højere i AKPfl/fl-mus end AKP270/fl-mus (28,0 vs. 24,2 pr. mus, P = 0.054; Supplerende tabel 1), og AKPfl/fl- og AKP270/fl-musene udviste ikke signifikante forskelle i forekomsten af adenocarcinomer (7,3 vs. 8,9 adenocarcinomer pr. mus, Supplerende tabel 1 øverst til højre, P = 0,16). Desuden blev invasion af nogle tumorer i muscularis propria, subserosa eller serosa set i både AKP270/fl- og AKPfl/fl-musene (Fig. 1b og Tabel 1). Da kun omkring 30% af tumorerne fra AKP270/fl- eller AKPfl/fl-musene udviklede sig til adenokarcinomer i løbet af undersøgelsesperioden, er yderligere somatiske ændringer ud over Apc-, Kras- og Trp53-defekter sandsynligvis kritiske i generering af karcinomer i AKP-musene.

Tumorhistologi og metastase i AKP270/fl- eller AKPfl/fl-mus

Hver af AKP270/fl- og AKPfl/fl-musene udviklede et eller flere adenokarcinomer på det tidspunkt, hvor de humane endepunkter blev nået. I AKP270/fl-mus viste mere end 80 % af adenokarcinomerne godt til moderat differentierede træk, med tumorknopper/udspring ved invasionsfronten og lejlighedsvis mucinsekretion (Fig. 2a, øverst). Omkring 15-20 % af AKP270/fl adenokarcinomerne var dårligt differentierede med en fast morfologi af trabekulær type (Fig. 2a, midten). Der blev set sjældne signet-ringcellekarcinomer hos AKP270/fl-mus (Fig. 2a, nederst). I AKPfl/fl-mus var ca. 50 % af adenokarcinomerne godt til moderat differentierede med mucinudskillelse (Fig. 2b, øverst); de resterende var dårligt differentierede (Fig. 2b, nederst). Der blev set kraftig nukleær og cytoplasmatisk farvning af β-catenin i invasive AKP270/fl- og AKPfl/fl-tumorer (Fig. 2, midten), hvilket stemmer overens med defekt Wnt-signalering som følge af Apc-inaktivering. Der blev observeret kraftig nukleær farvning for p53 i AKP270/fl tumorceller. Som forventet blev der ikke set nogen p53-farvning i AKPfl/fl tumorceller (Fig. 2, højre).

Histologiske typer af colon adenocarcinomer fra p53 mutante mus. H&E-farver (venstre paneler) og immunohistokemiske farvninger for β-catenin (midterste paneler) og p53 (højre paneler) er vist for uafhængige kolon-tumorer af repræsentative histologiske typer fra AKP270/fl-musene (a) og AKPfl/fl-musene (b). Tumorerne blev indsamlet 3 måneder efter TAM-induktion. Skala barer: 50 μm

Ved nekropsi blev der fundet lymfeknudemetastaser hos 3 af 13 AKPfl/fl-mus og 5 af 14 AKP270/fl-mus (tabel 2). Blandt de tre AKPfl/fl-mus, der hver især havde en metastase til en abdominal lymfeknude, havde en mus også flere metastaser til lungen, og en anden mus havde flere metastaser til leveren (tabel 2). Blandt de fem AKP270/fl-mus, der hver havde en metastase til en abdominal lymfeknude, havde en mus flere metastaser til lungen, og en anden havde metastaser i både lunge og lever (tabel 2). Der blev ikke fundet nogen metastaserende læsioner hos AK- eller AKP270/+-musene (tabel 2). Vores data viser, at CRC-mus med missense- eller nulmutationer i Trp53 kan give anledning til spontane lymfeknude- og fjernmetastaser med sammenlignelige frekvenser, hvilket taler imod en GOF-effekt for missense Trp53-mutationer i forbindelse med forbedring af metastase i vores CRC-musmodel.

Epithelial-mesenchymal overgang i metastaserende CRC’er med missense- eller null Trp53

I de enkelte lymfeknudemetastaserende aflejringer fundet i hver af fem forskellige AKP270/fl-mus, fire læsioner viste moderat differentieret adenokarcinom og en læsion var dårligt differentieret (Fig. 3a, b, øverste paneler). Alle de moderat differentierede lymfeknudemetastaserede læsioner havde stærk nukleær β-cateninfarvning samt stærk membranfarvning for E-cadherin og fraværende vimentinfarvning (Fig. 3a), hvilket tyder på bevarelse af epitheliale egenskaber i AKP270/fl-metastaserede celler, der bevarede moderat differentierede træk. I den ene AKP270/fl-mus, hvor lymfeknudemetastasen havde svagt differentierede egenskaber, blev der også fundet adenokarcinomlæsioner med svagt differentieret morfologi i lunge, lever og cecum (Fig. 3b og Supplerende Fig. 1). Den dårligt differentierede cecumlæsion og de metastatiske læsioner viste stærk nukleær β-cateninfarvning og tab af E-cadherinekspression og stærk vimentinekspression, hvilket stemmer overens med epithelial-mesenkymal overgang (EMT) træk (Fig. 3b og Supplerende Fig. 1). Alle metastatiske læsioner i AKP270/fl-musene farvede positivt for CDX2 (Supplerende fig. 2), hvilket er i overensstemmelse med deres colonepiteliale oprindelse.

Colonafledte metastaserende tumorer med missense Trp53-mutationer kan gennemgå epithelial-mesenchymal transition (EMT). Fotomikrografer af H&E-farvede snit, der viser lymfeknude- og lungemetastaser fundet i to repræsentative AKP270/fl-mus (a, b, øverste paneler). Immunohistokemiske farvninger, der viser stærk nukleær ekspression af β-catenin, stærk membranekspression af E-cadherin og fravær af vimentin-ekspression for de moderat differentierede læsioner, der blev fundet i en repræsentativ mus (a, de tre nederste paneler). I modsætning hertil viser de dårligt differentierede læsioner fundet i en anden mus (b) stærk nukleær ekspression af β-catenin, tab af E-cadherin-ekspression og stærk ekspression af vimentin, hvilket indikerer, at de metastatiske læsioner fundet i denne mus har undergået EMT (b, nederste tre paneler). De repræsentative fotomikrografer af H&E-farvede sektioner blev vist med lav forstørrelse til orientering; de serielle sektioner blev underkastet immunohistokemisk farvning, og det indrammede område med farvninger for β-catenin, E-cadherin og vimentin blev vist med høj forstørrelse. Skalaer: 20 μm for alle billeder

To af de tre lymfeknudemetastaser fra tumorbærende AKPfl/fl-mus var moderat differentierede, og én var dårligt differentieret (Fig. 4a, b, øverste paneler). AKPfl/fl-musen med levermetastase havde en moderat differentieret lymfeknudemetastase. I denne mus med levermetastaser viste det formodede indeks colon primær adenocarcinom samt lymfeknude- og levermetastaserede læsioner alle stærk nukleær ekspression af β-catenin og stærk membranekspression af E-cadherin (Supplerende fig. 3). I den enkelte AKPfl/fl-mus med en dårligt differentieret lymfeknudemetastase blev der også fundet flere læsioner med lignende morfologi i dens lunge (fig. 4b). Immunohistokemiske undersøgelser viste, at de lungemetastaserende læsioner og det formodede indeks primære adenocarcinom i cecum alle havde stærk nukleær ekspression af β-catenin og reduceret E-cadherin ekspression og stærk vimentin ekspression, hvilket er i overensstemmelse med EMT i den primære cancer og de metastaserende celler (Fig. 4b). De metastatiske læsioner i AKPfl/fl-musene var alle CDX2-positive (Supplerende fig. 4). Samlet set viser vores data, at der ikke er nogen signifikant forskel i de histologiske træk ved metastaserede læsioner, der opstår i AKP270/fl-mus eller AKPfl/fl-mus, og den dårligt differentierede undergruppe af de primære tumorer og metastaserede læsioner med missense eller null Trp53-mutationer kan manifestere EMT-træk.

Metastatiske tumorer afledt af kolon med nul Trp53-mutationer kan gennemgå epithelial-mesenchymal overgang (EMT). a Fotomikrografi af et H&E-farvet snit, der viser en moderat differentieret tumorlæsion fundet i lymfeknuden hos en repræsentativ AKPfl/fl-mus 2,5 måneder efter TAM-injektion (øverste panel). Immunohistokemiske farvninger for denne læsion viser stærk nukleær ekspression af β-catenin, stærk membranekspression af E-cadherin og fravær af vimentinekspression (nederste tre paneler). b Fotomikrografer af H&E-farvede snit, der viser de svagt differentierede læsioner, der er fundet i cecum, lymfeknude og lunge hos en anden AKPfl/fl-mus 4 måneder efter TAM-injektion (øverste panel). Alle disse læsioner viser stærk nukleær ekspression af β-catenin, tab af E-cadherin-ekspression og stærk ekspression af vimentin, hvilket indikerer, at de primære og metastatiske læsioner, der er fundet i denne mus, har gennemgået EMT (nederste tre paneler). De repræsentative fotomikrografer af H&E-farvede sektioner blev vist med lav forstørrelse til orientering; de serielle sektioner blev underkastet immunohistokemiske farvninger, og det boksede område med farvninger for β-catenin, E-cadherin og vimentin blev vist som høj forstørrelse. Skalaer: 20 μm for alle billeder

Stabilisering af missense mutant p53-protein er forbundet med tab af wild-type p53 og sygdomsprogression

De fleste humane tumorer med missense TP53-mutationer er blevet rapporteret til at vise TP53 tab af heterozygotitet (LOH) , og en undersøgelse viste, at TP53 LOH er en forudsætning for missense mutant p53-stabilisering i både musesarkomer og brystkarcinomer . Vi evaluerede p53-farvningsmønstre på forskellige stadier af tumorudvikling i AKP270/+-mus efter induktion af tumorigenese ved TAM-injektion, fordi det Cre-målrettede kolonepithel i AKP270/+-mus oprindeligt har én funktionel Trp53-allel. I hyperplastiske polypper i AKP270/+-mus, hvor Kras er aktiveret, og Apc LOH endnu ikke var opstået, er p53-farvning ikke påviselig (Fig. 5b, panel HP), svarende til den negative farvning for p53, der ses i epitelet hos vildtype-mus (Fig. 5a), selv om p53 R270H missense mutantprotein er konstitutionelt udtrykt i kolonvæv hos AKP270/+-musene. Der blev tydeligt set en vis p53-immunoreaktivitet i adenomer (Fig. 5b, panel adenom og Tabel 3, n = 185) og karcinomer (Fig. 5c og Tabel 3, n = 28), der opstod i AKP270/+-mus. Blandt disse tumorer viste 94 % af adenomerne og 43 % af karcinomerne svag p53-farvning (Fig. 5 og Tabel 3, 5-10 % positivitet), mens 6 % af adenomerne og 57 % af karcinomerne havde stærk p53-farvning (Fig. 5 og Tabel 3, >10 % positivitet, P < 0,0001). Størstedelen af tumorerne med stærk p53-farvning viste p53 LOH, mens tumorerne med svag p53-farvning stadig beholdt Trp53-wildtypeallelen (Fig. 6). Vores resultater svarer til dem, der er set i nyere arbejde om p53 missense proteinudtryk i musesarkomer og brystkarcinomer . Vores data viser, at i lighed med situationen i human kolon-tumorigenese , er ekspression af en stabiliseret missense mutant p53-protein tæt korreleret med tab af wild-type p53-funktion og progression til invasion.

Stabiliseringen af p53R270H mutantprotein under tumorprogression fra hyperplasi til karcinom i AKP270/+ mus. Immunohistokemisk farvning af p53 i en repræsentativ hyperplastisk polyp (HP, b, venstre panel), et adenom (b, højre panel) og tre karcinomer (c), der opstår i cecum hos AKP270/+-mus. Et snit fra cecum fra en vild-type mus blev anvendt som kontrol (a). P53-farvningen varierer fra ikke-detekterbar farvning i de normale (a) og HP (b) sektioner, til svag farvning (<10% positivitet) i adenom (b) og karcinom 1(c, venstre panel) og til stærk farvning i karcinom 2 og 3 (>10% positivitet). De stiplede linjer angiver muscularis mucosae. Sorte pile angiver de invasive kirtler med svag p53-farvning; røde pile angiver den invasive kirtel med stærk p53-farvning. Skalaer: 50 μm

Stabiliseringen af p53R270H missense mutant er korreleret med p53 loss-of-heterozygosity (LOH). a Genotyping af colon-tumorer (T2-T6), der opstår i AKP270/+ mus 5 måneder efter TAM-induktion. En tumor, der opstår i en AKP270/fl-mus (T1), og kolonvæv fra en vild-type mus (N) anvendes som henholdsvis positiv og negativ kontrol. Tilstedeværelsen af Trp53-wildtypeallelen og rekombineret Trp53-mutantallel (flox out) blev påvist ved PCR. b-e Immunohistokemisk farvning af p53 i kolonvæv beskrevet i (a) viser en stærk korrelation mellem mutant-p53-stabilisering (d, T2 og T3) og p53-tab af heterozygotitet sammenlignet med den svage p53-færgning og tilstedeværelsen af Trp53-wildtypeallel i tumorer 4-6 (e). De stiplede linjer angiver muscularis mucosae. Skalaer: 100 μm

Global genekspressionsprofilering afslører få forskelle mellem tumorceller fra mus eller humane tyktarm, der bærer R270H/R273H missense mutant og null Trp53/TP53-alleler

Vi profilerede genekspression i væv fra tyktarmsadenokarcinom fra AKP270/fl-mus (n = 6) eller AKPfl/fl (n = 6) mus ved hjælp af Affymetrix Mouse ST 2.1 Arrays med 24.562 probe-sæt. Vi isolerede RNA efter laser capture microdissection (LCM) af kræftceller fra en invasiv primær tumor fra hver mus. Som kontrol blev mikrodissekterede normale kolonepithelceller fra vildtype-mus (n = 3) medtaget som kontrol. Vi tilpassede ANOVA-modeller til disse 15 prøver med termer for 3 middelværdier. Sammenligninger af tumorvæv med normalt væv gav over 2400 probe-sæt med P < 0,001 for både AKP270/fl- og AKPfl/fl-tumorer, men sammenligning af de to tumortyper med hinanden gav kun 30 probe-sæt, hvor vi forventer 24,6 probe-sæt (24.562*0,001) blot ved tilfældighed. Sidstnævnte resultat indikerer, at de fleste af de 30 fundne probe-sets er falsk positive (tabel 4, øverste del), og der var få eller ingen signifikante observerbare forskelle i genekspression mellem tyktarmstumorer med Trp53-missense-mutationer og dem med Trp53-nul-mutationer. I overensstemmelse med denne opfattelse fandt vi, at AKP270/fl- og AKPfl/fl-adenokarcinomer ikke kunne skelnes fra hinanden i hovedkomponentanalyser (PC) af genekspression, selv om begge grupper af tumorer har genekspressionsmønstre, der klart adskiller sig fra kolonepitelet af vild type (Supplerende fig. 5).

Vi udførte også Affymetrix-genekspressionsanalyse på organoider, der stammer fra kolon-tumorer, der stammer fra AKP270/fl-mus (n = 3) eller AKPfl/fl-mus (n = 2). Organoider afledt af adenomer i Apcfl/fl-mus (Cont 1, n = 3) eller fra kolonepithel af vild type (Cont 2, n = 4) blev anvendt som kontrol. Vi tilpassede en ANOVA-model til de fire grupper af organoider. Vi fandt 435 sonde-sæt med P < 0,001 for AKPfl/fl-organoider og 609 sonde-sæt for AKP270/fl-organoider sammenlignet med Apc-null-organoider (Cont 1, Tabel 4). Desuden blev der identificeret flere differentielt udtrykte sonde-sæt (960 for AKPfl/fl og 1332 for AKP270/fl, P < 0,001), når AKPfl/fl- eller AKP270/fl-organoider blev sammenlignet med normale kolonorganoider (Cont2, Tabel 4). Vi udførte pathway-berigelsestest på gener, der blev differentielt udtrykt i både AKPfl/fl- og AKP270/fl-tumorer og organoider sammenlignet med normalt colon-epithel. Vi fandt, at en række veje var signifikant ændret i både p53-nul og missense mutant tumorafledte celler, med gener involveret i G2M-kontrolpunktet, cellevækst, stressrespons og cellemetabolisme som de mest signifikant ændrede genesæt (Supplerende tabel 2). Vi opnåede imidlertid kun 35 probe-sæt med P < 0,001 for AKPfl/fl vs. AKP270/fl sammenligning (Tabel 4), hvor igen 24,6 var forventet ved tilfældighed, hvilket viser, at det var vanskeligt at finde genekspressionsforskelle mellem organoiderne med nul- og missense Trp53-mutationer. PC-plots viste, at AKPfl/fl- og AKP270/fl-prøverne altid var grupperet sammen og var adskilt fra organoider afledt af Apc-mutante adenomer (Cont1, Supplerende fig. 6) eller normalt kolonepitel (Cont2, Supplerende fig. 6).

For at teste, om der var påviselige forskelle i genekspressionsmønstre mellem menneskelige CRC’er med missense og nul TP53-mutationer, analyserede vi log2-transformerede normaliserede tællinger fra RNA-seq-data for CRC’er i The Cancer Genome Atlas (TCGA) , idet vi sammenlignede 9 tumorer med TP53 codon 273 missense-mutationer med 36 tumorer med nul-mutationer (forårsaget af frame shift, splejsestedet og nonsense-mutationer, se supplerende tabel 3 for detaljer) ved hjælp af T-test med to stikprøver for 20531 gener. Vi fandt kun 244 gener med P < 0,01 og 30 gener med P < 0,001, hvilket kun var lidt mere end det antal, der forventes ved tilfældighed (henholdsvis 205 og 20,5, Tabel 4). TP53 selv gav den mest signifikante forskel i genekspression, idet den var næsten 5 gange lavere i gennemsnit i tumorer med nulmutationer i forhold til TP53 codon 273-mutationer (Supplerende tabel 4, P = 2 × 10-10). Igen fandt vi kun en lille adskillelse af de to sæt tumorer i PC-analysen (Supplerende figur 7). I overensstemmelse med den lignende transkriptionelle signatur tilpassede vi Cox proportional hazard-modeller til 43 patienter med overlevelsesdata, idet vi anvendte alder, stadium og TP53-status i modellen og ikke fandt nogen signifikant sammenhæng mellem patientresultatet og TP53-mutationsstatus (R273 missense-mutation vs. nul-mutation, Supplerende tabel 5, P = 0,67 ved Wald-test). Det er værd at nævne, at med kun 7 dødsfald blandt disse patienter var kraften til at påvise forskelle ret lav. Endelig kiggede vi på krydsningen af gener, der gav P < 0,05 i et af de tre datasæt beskrevet ovenfor (dvs. humane og musekolon-tumorer, musekolon-organoider), der ændrede sig i samme retning for Trp53/TP53 missense vs. null-sammenligning. I Supplerende tabel 4 viser vi gener, der gav P < 0,05 og fold-ændringer på mindst 1,3 i to af de tre datasæt. Vi fandt kun Trp53/TP53, der ændrede sig i samme retning i alle tre undersøgelser (Supplerende tabel 4; den detaljerede statistik for hvert gen i alle tre datasæt er tilgængelig i vores offentlige GEO-serie). Samlet set viser vores genekspressionsanalyser for CRC’er i mus og mennesker, at tyktarmstumorer med R270/R273 missense eller null Trp53/TP53-mutationer har meget ens genekspressionsprofiler, hvilket er i overensstemmelse med fraværet af større forskelle i biologiske egenskaber i tyktarmstumorer og fænotyper, der opstår in vivo i AKP270/fl og AKPfl/fl-mus.