Shurtig lateral flow immunoassay til fluorescensdetektion af SARS-CoV-2 RNA

I HC-FIA-systemet forstærker DNA-funktionaliserede FNP’er til sonde DNA-sonden signalet fra hybridiseringen af viralt RNA og DNA’et i sonden. Konstruktionsprincippet for HC-FIA-biosensoren er vist i fig. 1.

Design og funktion af HC-FIA-assayet

Den murine S9.6 monoklonale antistoffer er præfikseret på testlinjen (T) på lateral flow-striben, og kontrollinjen (C) er belagt med polyklonale anti-kanin-IgG-antistoffer fra geder (fig. 1a). FNP’er, der er mærket med S9.6-antistoffer og kanin-IgG, anbringes i reaktionsrøret. I begyndelsen af detektionsprocessen lyseres og frigøres SARS-CoV-2 i svaber- eller sputumprøven, og det frigjorte RNA hybridiseres med den specifikke SARS-CoV-2-DNA-sonde. Den fremkomne RNA-DNA-hybrid indfanges af de FNP-mærkede S9.6-antistoffer, og komplekset strømmer langs prøvepuden og nitrocellulosemembranen mod det absorberende papir under kapillære kræfter. Når komplekset passerer gennem T-området, indfanges det af S9.6-antistofferne, og der dannes gradvist et fluorescerende signal. I C-området opfanges FNP-mærket kanin-IgG af anti-kanin-IgG. Tilstedeværelsen eller fraværet af SARS-CoV-2 RNA-målet er baseret på en grænseværdi for fluorescensintensiteten (fig. 1b,c). Figur 1d viser et bærbart kuffertlaboratorium, der har mulighed for at give kvalitative resultater på mindre end en time efter de følgende to trin: hybridisering og immunofluorescensanalyse (fig. 1e).

Her anvendte vi forholdet mellem testfluorescenssignalet og kontrolfluorescenssignalet (T/C) på lateralflowstriben, således at indflydelsen fra en eventuel baggrundsfluorescens fra testkortet blev minimeret. Ved at måle T/C-forholdet af svaberprøver fra 211 raske personer fandt vi, at det gennemsnitlige baggrunds-T/C-forhold var 49,95 med en s.d. på 17,16 (Supplerende fig. 1a). ROC-kurven (receiver operating characteristic) og arealet under kurven (AUC) blev anvendt til at bestemme cut-off-værdien og vurdere HC-FIA-assayets diagnostiske nøjagtighed på grundlag af sensitivitet og specificitet ved forskellige tærskelværdier. Vi bestemte en ROC-kurve med en AUC på 0,999 med et 95 % konfidensinterval (CI) på 0,997-1,000 (Supplerende fig. 1b) ved hjælp af svaberprøver fra halsen fra 100 klinisk bekræftede og udelukkede COVID-19-tilfælde. Den cut-off-værdi, der opnåede den højeste sensitivitet og specificitet, blev bestemt til at være 102,07, svarende til Youden-indekset på 0,980. Alternativt anvendes normalt en tærskelværdi på det dobbelte af den negative baggrundsværdi (her 49,95 × 2 = 99,90) som cut-off-værdi i immunoassays. For nemheds skyld valgte vi en T/C cut-off-værdi på 100,00.

HC-FIA-assayudvikling

Optimering af DNA-sonder til mål-RNA-sekvensen af SARS-CoV-2 er nøglen til at forbedre assayets effektivitet. En liste over alle de DNA-sondesekvenser, som vi har designet, findes i den supplerende tabel 1. Genomet af SARS-CoV-2 består af ca. 30 000 baser, herunder et variabelt antal (6-11) åbne læserammer (ORF’er). Den første ORF udgør ca. 67 % af hele genomet og koder for 16 ikke-strukturelle proteiner samt hjælpeproteiner og strukturelle proteiner. De fire vigtigste strukturelle proteiner er spideglykoproteinet (S), det lille hætteprotein (E), matrixproteinet (M) og nucleokapsidproteinet (N)15,16. De fleste nukleinsyre-detektionsassays for SARS-CoV-2 anvender følgende tre bevarede regioner i viralgenomet: ORF1ab, hvor det RNA-afhængige polymerase-gen (rdrp) er placeret15 , og de regioner, der koder for N og E.

Vi begyndte med at hente RNA-genomsekvensen af SARS-CoV-2 fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (adgangsnumre, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 og NC_045512.1). En detaljeret analyse af andre offentliggjorte sekvenser for SARS-CoV-2-genomet afslørede ingen bemærkelsesværdig variation i disse regioner. Ved hjælp af designsoftwaren Primer Premier 5.0 designede vi tre sonder for hver af de tre regioner: CoV01 og CoV04, der er placeret i den anbefalede region til påvisning af henholdsvis ORF1ab og N, og CoV08, der er placeret i samme region som E17. Sondenes bindingsstedernes genompositioner i referencegenomsekvensen (NC_045512.2) er angivet i fig. 1f.

Sekvenstilpasning blev foretaget mellem de designede DNA-sonder og sekvenser fra det menneskelige genom og fra genomer af vira, bakterier, mycoplasmaer, chlamydia og andre almindelige patogener. Sonderne matchede kun SARS-CoV-2-genomsekvensen, og vi fandt ingen homologi med humant genomisk DNA. Pseudovirusser med forskellige regioner af målgenet, der er konstrueret ved hjælp af lentivirusser som vektorer, blev anvendt som positive kontroller. Målgensekvenserne for de anvendte pseudovirusser er vist i den supplerende tabel 2. P1 var positiv for SARS-CoV-2 N-regionen, P2 for SARS-CoV-2 E-regionen og P3 for SARS-CoV-2 ORF1ab-regionen. Koncentrationen af de tre positive kontroller var 3 000 transduktionsenheder (TU) ml-1, hvilket indikerer, at der var 3 000 infektiøse viruspartikler pr. ml. Fysiologisk saltvand, renset vand og svaberprøver fra svælget i svælget, der var positive for andre almindelige patogener, blev anvendt som negative kontroller af N1-N17. En liste med oplysninger om de positive og negative referencer, der blev anvendt i undersøgelsen, findes i den supplerende tabel 3. Testresultaterne er vist i de supplerende tabeller 4-6. For ORF1ab-regionen blev proberne CoV01 og CoV03 valgt; for E-regionen blev proben CoV08 valgt; og for N-regionen blev proberne CoV04 og CoV06 fortrinsvis bundet til mål-RNA’et. De udvalgte DNA-sonder blev yderligere optimeret ved kombination (Supplerende tabel 7), idet hver gruppe af sonder samtidig var rettet mod alle tre segmenter. HC-FIA-testresultaterne i supplerende tabel 8 viser, at kombinationen af Cov01-, Cov04- og Cov08-sonderne (gruppe 2) diskriminerede mellem alle de positive kontrolprøver og de negative kontroller og påviste positive prøver med en lav viral titer (1 000 TU ml-1; supplerende tabel 3, L1-L3) med en positiv rate på over 95 %. Gruppe 2 blev derfor valgt som den endelige kombination. Indtil nu er der 13 411 SARS-CoV-2-nukleotidsekvenser offentliggjort på NCBI. Alignment af de tre prober med den tilsvarende målregion i de 13 411 uploadede sekvenser viste, at målregionerne i proberne var bevaret nok til at give 100 % lighed.

Vi optimerede også testbetingelserne for assayet, især inkubationstiden for hybridisering og teststrimmens aflæsningstid. Assayets ydeevne for inkubationstider på 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min og 60 min ved 56 °C er vist i supplerende tabel 9. Bemærk, at 20 min var nok til, at DNA-sonderne kunne hybridisere med målområdet, hvilket blev afspejlet af den 100 % positive rate ved påvisning af positive svaberprøver fra halsen og sputumprøver med lav virustiter (1 000 TU ml-1; Supplerende tabel 3, L1-L3). Når inkubationstiden blev forlænget til 50 eller 60 minutter, var reaktionen ikke så stabil, da den positive rate af L1-L3-referenceprøverne faldt. Under hensyntagen til detektionseffektiviteten og kravet om virusinaktivering valgte vi 30 min som inkubationstid for hybridisering ved 56 °C. Vi vurderede også stripens aflæsningstid for værdierne 10 min, 12 min, 15 min og 18 min (Supplerende tabel 10). Resultaterne viste, at 12 min eller længere førte til korrekt detektion af de positive og negative referenceprøver. Variationskoefficienten (CV) var dog kun lavere end 10 % for detektion af positive prøver med en lav viral titer, når der blev anvendt en aflæsningstid på 15 min. Vi valgte derfor en aflæsningstid på 15 min.

Guanidiniumthiocyanat og guanidinklorid – de mest anvendte proteindenatureringsmidler til nukleinsyreekstraktion – blev sammenlignet som transportmedier til prøvens konservering. Guanidiniumthiocyanat førte til bedre resultater med hensyn til at skelne mellem positive og negative prøver, med et relativt lavt CV for prøver med en lav viral titer. Faktisk har guanidiniumthiocyanat i en koncentration på helt op til 6 mol l-1 vist fremragende antivirale egenskaber18. Vi valgte guanidiniumthiocyanat i en koncentration på 5 mol l-1 som proteindenatureringsmiddel til viral inaktivering i transportmediet.

Specificitet af HC-FIA-assayet

Efter optimering af sonde-sekvenserne og reaktionsbetingelserne undersøgte vi HC-FIA-assayets specificitet til påvisning af SARS-CoV-2. De positive kontroller omfattede pseudovirus (prøverne P1-P3) med målgener og fem kliniske svaberprøver fra halsen (prøverne P4-P8), som blev bekræftet ved hjælp af et RT-qPCR-baseret nukleinsyre-detektionssæt (Shanghai ZJ Bio-Tech). De negative kontroller, som bestod af svaberprøver fra halsen, blev bekræftet som værende negative for SARS-CoV-2 og positive for influenza A, influenza B, respiratorisk syncytialvirus, chlamydia pneumoniae, adenovirus eller andre patogener (prøver N5-N17) eller pseudovirus-positive for N-regionen af MERS (prøve N18) eller SARS (prøve N19). En liste over alle prøverne findes i tillægstabel 3. En liste over detektionsresultaterne for 8 positive referenceprøver og 15 negative referenceprøver findes i supplerende tabel 11.

Vi undersøgte, om der var krydsreaktivitet mellem SARS-CoV-2 og 55 almindelige patogener, der forårsager luftvejssygdomme. Kilde og kvantitative oplysninger om hver enkelt patogen mikroorganisme findes i supplerende datasæt 1. Den oprindelige virustiter blev bestemt til 106 plakdannende enheder pr. ml ved hjælp af en plakassay. For interferensprøver af bakterier, mycoplasma og chlamydia var koncentrationsniveauet 107 koloni- dannende enheder pr. ml. Desuden blev humant genomisk DNA ekstraheret og kvantificeret til 90-105 µg ml-1 fra tre fuldblodsprøver. HC-FIA-assayet udviste fremragende specificitet for SARS-CoV-2 uden nogen tydelig krydsreaktivitet med alle de andre patogenprøver og humant genomisk DNA (Supplerende datasæt 1).

Da det monoklonale antistof S9.6 også binder til RNA-RNA-duplekser19 , især AU-rige duplekser20 , designede vi dobbeltstrengede RNA-sekvenser med varierende fraktioner af AU. Detaljerede sekvensoplysninger findes i den supplerende tabel 12. Som det fremgår af supplerende tabel 13, viste HC-FIA-assayet uanset AU-indholdet ikke et påviseligt positivt signal over for dobbeltstrenget RNA, hvilket tyder på, at der er en lav bindingsaffinitet mellem S9.6-antistoffet og dobbeltstrenget RNA under assaybetingelserne. Vi undersøgte også, om tilstedeværelsen af dobbeltstrenget RNA påvirker assayets ydeevne ved påvisning af kliniske svaberprøver fra halsen eller sputumprøver. Vi anvendte 2 positive halssvaberprøver, 2 positive sputumprøver, 10 negative halssvaberprøver og 5 negative sputumprøver. Vi målte T/C-forholdet i forhold til T/C-værdierne i den interferensfrie test og fandt, at forholdet lå mellem 0,9 og 1,1 (Supplerende datasæt 1). Dette indikerer, at tilstedeværelsen af dobbeltstrenget RNA, uanset AU-indholdet, ikke påvirker HC-FIA-assayets ydeevne væsentligt.

HC-FIA-assayets følsomhed og præcision

Vi fortyndede serielt pseudovirusprøverne indeholdende tre sektioner af målgenerne til titre på 5.000, 2.500, 1.000, 800, 500, 250 og 100 TU ml-1 og beregnede de gennemsnitlige T/C-værdier for 20 paralleltest. Figur 2a viser, at detektionsgrænsen (LOD-værdierne) for pseudovirus, der var positive for N-, E- eller ORF1ab-regionerne af SARS-CoV-2, var så lav som 1 000 TU ml-1 med en positiv rate på mere end 95 %. Da titrene af pseudovirusprøver nåede op på 108 TU ml-1, blev der ikke observeret nogen bemærkelsesværdig krogeffekt (supplerende figur 2). Assayets lineære område svarer til titre mellem 103 og 106 eller 107 TU ml-1.

De lodrette akser viser fluorescens-intensitetsforholdet (T/C) for testsignalet (T) og kontrolsignalet (C). For hver koncentration blev der udført 20 forsøg parallelt. LOD blev bestemt som den koncentration, hvor den positive rate var større end eller lig med 95 %. a, T/C-forhold for serielt fortyndede pseudovirusprøver, der er positive for N-, E- og ORF1ab-regionerne af SARS-CoV-2. b, T/C-forhold for serielt fortyndede svaberprøver fra halsen fra tre kritisk syge patienter. Data er gennemsnit ± s.d.

Hals-svaberprøver fra tre kritisk syge patienter – som blev bestemt til at være positive for SARS-CoV-2 ved hjælp af RT-qPCR, og de virale belastninger blev kvantificeret ved hjælp af digital PCR – blev blandet med negative halssvaberprøver for at fremstille serielle fortyndinger på 2 000, 1 000, 500, 400 og 250 kopier pr. ml. Som det fremgår af fig. 2b, var LOD 500 kopier pr. ml med en positiv rate på mere end 95 %. Kliniske svaberprøver fra halsen med T/C-værdier tæt på den kritiske værdi (100) for positivitet (prøver med 512, 489 og 497 kopier pr. ml af ORF1ab-regionen i henhold til digital PCR) blev anvendt til at verificere LOD (test udført 20 gange parallelt). De positive satser for disse prøver var højere end 95 % (supplerende tabeller 14-16).

For at evaluere HC-FIA-sættets præcision blev der udført paralleltest 20 gange for hver klinisk svaberprøve fra halsen i fem på hinanden følgende dage. De valgte repræsentative kliniske prøver var en positiv prøve (1 348 kopier pr. ml af ORF1ab-regionen), en prøve fra en kritisk syg person (kritisk; 512 kopier pr. ml) og en negativ prøve (0 kopier pr. ml). De gennemsnitlige T/C-værdier for de tre batches ved påvisning af den positive prøve var som følger: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13 %), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94 %) og 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73 %), sammenlignet med henholdsvis 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65 %), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) og 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) for den kritiske prøve og med 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) og 44,72 ± 2,98 (CV = 6,18%) for den kritiske prøve og med 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) og 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66 %) for den negative prøve. CV-værdierne fra batch til batch var 3,89 %, 4,66 % og 6,74 %. Assayet viste således god præcision og reproducerbarhed til påvisning af SARS-CoV-2.

Robusthed af HC-FIA-assayet

For at få kendskab til HC-FIA’s robusthed evaluerede vi virkningerne af endogene interferensstoffer (såsom hæmoglobin og mucin) og af eksogene interferensstoffer (især kliniske lægemidler, der almindeligvis anvendes i behandlingen af patienter med luftvejsinfektioner, herunder antivirale lægemidler, antibiotika og hormoner). Til dette forsøg blev der anvendt 18 kliniske svaberprøver fra halsen, herunder seks kritiske prøver (500-530 kopier pr. ml for ORF1ab-regionen i henhold til digital PCR), seks negative prøver og seks positive prøver. Resultaterne blev også registreret som forholdet mellem T/C-værdierne (interferensprøver i forhold til kontrolprøver). I de forberedte interferensprøver var hæmoglobinkoncentrationerne 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 og 2,0 g l-1, og koncentrationerne for mucin var 5 g l-1, 10 g l-1 og 20 g l-1. Lægemiddelkoncentrationerne i de eksogene interferensprøver (supplerende tabeller 17-19) var meget højere end deres maksimale plasmakoncentrationer in vivo. Som forventet lå alle T/C-forholdet i intervallet 0,9-1,1 (Supplerende datasæt 2), hvilket indikerer, at HC-FIA-assayet er robust over for interferens.

Klinisk evaluering af HC-FIA-testsættet

For yderligere at evaluere HC-FIA-assayets ydeevne blev der udført et randomiseret dobbeltblindet klinisk forsøg ved at sammenligne assayet med RT-qPCR (SARS-CoV-2-detektionssæt produceret af Shanghai ZJ Bio-Tech og godkendt af NMPA) eller med kliniske diagnoseresultater i tre uafhængige medicinske institutioner. HC-FIA-testsættet, der blev anvendt i den kliniske evaluering, indeholdt testkort, lysisbuffer, prøveopbevaringsopløsning, positive og negative kontroller og et reaktionsrør med DNA-sonder og mærkede antistoffer. De kliniske diagnoseresultater for bekræftede eller udelukkede COVID-19-tilfælde, som blev leveret af de udpegede hospitaler, var baseret på computertomografibilleder og patienternes kliniske manifestationer som specificeret i retningslinjerne i “Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial Version 6.0)” fra Kina. I alt 734 prøver (593 svaberprøver fra halsen og 141 sputumprøver) fra 670 personer blev testet parallelt. De rå data fra de kliniske forsøg findes som supplerende datasæt 3. Det RT-qPCR-detektionssæt, som vi anvendte, var designet som et system med tre mål (ORF, N og E), og vi fulgte test-retest-princippet for at skelne mellem positive og negative prøver. Ud over fire fejlprøver forårsaget af en ugyldig intern standard blev der udført otte omprøver: én, fordi kun ét rdrp-målgen var positivt, og syv, fordi kun N- og E-generne var positive. I disse tilfælde blev de tidligere negative resultater udelukket.

Af de 670 patienter, der blev indskrevet i forsøget, var 313 mænd (46,72 %) og 357 kvinder (53,28 %). Som det fremgår af supplerende figur 3, svarer aldersfordelingen i den indskrevne population til aldersfordelingen for SARS-CoV-2-infektion21 . Besøgsfrekvensen og diagnosefrekvensen var også afbalancerede. Resultaterne fra HC-FIA-testsættene er vist i fig. 3, som viser fotografier af typiske resultater under en fluorescerende lyskilde og den tilsvarende gradientfarvematrix efter normalisering af aflæsningen. Gradientfarvematrixen i supplerende fig. 4 viser de normaliserede fluorescensaflæsninger af 734 kliniske prøver (supplerende datasæt 3).

Fotografier af typiske resultater under en fluorescerende lyskilde og de tilsvarende fluorescensaflæsninger som en matrix med farvegradient, normaliseret til den maksimale aflæsningsværdi. Gruppe E består kun af COVID-19-negative resultater. Den vandrette linje på farvebjælken angiver cut-off-værdien. En farvegradientmatrix for fluorescensudlæsningerne af 734 kliniske prøver findes i supplerende figur 4 og de tilsvarende numeriske data i supplerende datasæt 3.

For 621 tilfælde var HC-FIA-resultaterne og de kliniske diagnoser i overensstemmelse med hinanden (210 bekræftede tilfælde og 411 udelukkede tilfælde; tabel 1); 49 tilfælde (27 bekræftede og 22 udelukkede ved klinisk diagnose) var ikke i overensstemmelse med HC-FIA-resultaterne. For 730 prøver var resultaterne af HC-FIA-testen i overensstemmelse med RT-qPCR-resultaterne (249 positive og 481 negative; tabel 1). Fire prøver, der var negative på grundlag af RT-qPCR, var positive ved hjælp af HC-FIA. Tre af disse prøver var fra patienter, der klinisk var blevet diagnosticeret som COVID-19-ekskluderede, hvilket tyder på, at HC-FIA-testen havde givet falsk-positive resultater. Den resterende prøve svarede til et bekræftet tilfælde ved klinisk diagnose, hvilket var i overensstemmelse med HC-FIA-testen.

Cohen’s Kappa (κ), som er et hyppigt anvendt mål for pålideligheden af overensstemmelsen mellem kategoriske variabler, er et mere robust mål sammenlignet med simpel procentvis overensstemmelse mellem variablerne, da κ tager højde for overensstemmelser, der opstår tilfældigt, især i ubalancerede datasæt. Vi anså en κ-værdi på over 0,75 for at indikere en høj grad af overensstemmelse (perfekt overensstemmelse svarer til en κ = 1). Som det fremgår af tabel 2, var resultaterne fra HC-FIA-testen i høj grad i overensstemmelse med klinisk diagnose (κ = 0,8393) og med RT-qPCR (κ > 0,98, uanset prøvetype).