Enhedsdefinition
En enhed restriktionsendonukleaseaktivitet er defineret som den mængde enzym, der er nødvendig for at producere en fuldstændig fordøjelse af 1 µg substrat-DNA (eller fragmenter) i et samlet reaktionsvolumen på 50 µl på 60 minutter under optimale testbetingelser som angivet for hver enkelt restriktionsendonuklease.
Bestemmelse af restriktionsendonukleasernes volumenaktivitet
Restriktionsendonukleaseaktivitetsassays udføres ved at tilsætte forskellige enzymfortyndinger til den passende assaybuffer indeholdende 1 µg substrat-DNA. Efter 60 minutters inkubation ved passende temperatur stoppes fordøjelsen, og DNA-prøverne visualiseres ved agarosegel/ethidiumbromid-elektroforese. Den mest fortyndede enzymopløsning, der giver en fuldstændig fordøjelse, anvendes til beregning af aktiviteten i enheder/µl.
Bemærk venligst, at aktiviteten er substratafhængig, og når der arbejdes med et nyt substrat, bør enzymet titreres for at bestemme den faktiske eller forventede aktivitet.
Kvalitetskontrol
Resultaterne af alle kvalitetskontrolassays er rapporteret på det tekniske datablad, der følger med hvert enzym.
Overdigestionsassay
Et overdigestionsassay blev anvendt som en kvalitativ bestemmelse af enzymets renhed og af mangel på uspecifikke DNaser. I overfordøjelsesassayet tilsættes stigende mængder af hver restriktionsendonuklease (normalt 10, 20, 30, 40, 50 enheder) til en række rør, der indeholder 1 µg substrat-DNA. Efter 20 timers inkubation under de anbefalede forsøgsbetingelser bestemmes det maksimale antal enheder, der giver et klart, skarpt, normalt båndmønster, ved agarosegel/ethidiumbromidelektroforese.
For at bestå testen skal enzymet give et uændret båndmønster under betingelser med op til 600 gange overfordøjelsen (enheder x timer) sammenlignet med en 2 gange fordøjelsesmængde. Hvis enzymet udviser “stjerne”-aktivitet ved en lavere end 600-dobbelt funktionel overskridelse, indeholder produktbeskrivelsen oplysninger om den funktionelle overskridelse, ved hvilken “stjerne”-aktiviteten ikke forekommer.
Test for uspecifikke endonukleaser
For at teste for uspecifik endonukleaseforurening inkuberes hver restriktionsendonuklease med et supercoiled plasmid-substrat, der mangler restriktionsendonukleasens genkendelsessekvens. Et enkelt uspecifikt hak i RF I-DNA’et omdanner det til RF II-formen (hakket cirkel). Stigende mængder enzym (normalt 10, 20, 30, 40, 50 enheder) tilsættes til en række rør, der indeholder 1 µg RF I-DNA (supercoiled form). Efter 20 timers inkubation under de anbefalede forsøgsbetingelser skelnes der mellem de to former på agarosegeler, og den procentvise omdannelse fra RF I til RF II bestemmes.
Ligations- og omskæringstest
Der blev anvendt en ligationsanalyse til at bestemme DNA’ets funktionelle renhed efter restriktionsenzymfordøjelsen. Substrat-DNA fordøjes fuldstændigt med et 10- og 50-dobbelt overskud af restriktionsendonukleasen i den relevante assaybuffer, ligeres med T4-DNA-ligase og omskæres med det samme restriktionsenzym. De afskårne, ligerede og omskårne DNA’er analyseres ved agarosegel/ethidiumbromidelektroforese. Et normalt båndmønster indikerer intakte 5- og 3-terminaler samt fravær af kontaminerende nukleaser eller fosfataser.
Stabilitet
Alle Jena Bioscience restriktionsendonukleaser analyseres igen hver 4-6. måned. Denne proces giver os mulighed for at sikre fuld enzymaktivitet og optimal ydeevne i hvert enzym, vi sender. På grund af de fremragende resultater af denne testning har vi forlænget udløbsdatoerne for de fleste af vores enzymer til 18 måneder.