Radiometriske ligandbindingsanalyser | Application Support Knowledgebase | Lab Products & Services | PerkinElmer

top

Overblik

Radioaktive ligander bruges ofte til at måle ligandbinding til receptorer. I dette forsøg skal du måle bindingen af en radiomærket ligand til celler eller cellemembraner, der indeholder en receptor af interesse. Der kan anvendes både hele celler og cellemembraner til dette forsøg. Radioligander kan bruges til at udføre mætningskurver, konkurrence- og kinetiske eksperimenter.

Ligand-receptorbinding

Når man vælger en radioligand, er der nogle få faktorer, man skal være opmærksom på:

• Høj specifik aktivitet: Radioligander med en høj specifik aktivitet er velegnede til ligandbindingsanalyser. Specifik aktivitet angiver, hvor meget radioaktivitet der er pr. molekyle af ligand, og angives normalt i enheder af Curies pr. millimole ligand. Flere af vores 125I-mærkede ligander tilbydes med maksimal specifik aktivitet (2200 Ci/mmol, hvis der er et 125I-mærkningssted til rådighed, 4400 Ci/mmol, hvis der er to 125I-mærkningssteder til rådighed, osv.) Det betyder, at stort set alle de ligandmolekyler, der leveres i lagerflasken, er radiomærkede. For tritierede ligander (3H-ligander) bør man ideelt set vælge en ligand, der har en specifik aktivitet på over 20 Ci/mmol. Den maksimale teoretiske specifikke aktivitet pr. tritium er 29 Ci/mmol (Curies pr. millimole tritium). Specifikke aktiviteter over denne værdi angiver, at hvert ligandmolekyle i gennemsnit har mindst ét tritium.
• Lav uspecifik binding: Hydrofobiske ligander vil generelt udvise en højere uspecifik binding. Dette kan undertiden kompenseres ved at belægge filtre med BSA for at reducere den uspecifikke binding. Inddragelse af BSA, salte eller detergenter i vaske- eller bindingsbufferen kan også bidrage til at reducere den uspecifikke binding. Hvis den radiokemiske stamme er pakket i en silaniseret hætteglas (se det tekniske datablad), kan det være tegn på, at liganden er noget hydrofob
• Høj renhed: Ideelt set bør liganden have en radiokemisk renhed på over 90 %. Den radiokemiske renhed aftager med tiden, og den faktiske nedbrydningshastighed accelererer med tiden. Radiokemisk renhed og nedbrydningshastighed for vores forskellige radiokemiske stoffer kan findes på de partispecifikke tekniske datablade.
• Høj selektivitet: Jo mere selektivt liganden er for din receptor, jo bedre vil dine data være. Høj selektivitet indikerer, at liganden for det meste kun vil blive genkendt af én receptor af interesse frem for andre receptorer, der kan være til stede i en cellemembran. Desuden kan anvendelse af membraner, der overudtrykker den pågældende receptor, bidrage til at reducere ethvert potentielt bidrag fra receptorer, der er endogent udtrykt i membranen.
• Stabilitet: Hvis du skal bruge din radioligand i en længere periode, kan stabilitet være en faktor for dig. 125I-mærkede ligander bør generelt anvendes inden for en til to måneder efter fremstillingsdatoen. Tritierede ligander bør normalt anvendes inden for 3-6 måneder efter fremstillingsdatoen; der er dog undtagelser herfra. Nedbrydningshastigheder og fremstillingsdatoer kan findes på vores partispecifikke tekniske datablade. Du kan også kontakte teknisk support for at drøfte den anbefalede brugstid for hvert enkelt radiokemikalie fra PerkinElmer – vores kontaktoplysninger findes i øverste højre hjørne af denne side.
• Energi: 3H frigiver beta-energi, som kan måles på en scintillationsmåler efter tilsætning af scintillant (i form af en scintillationscocktail, Meltilex® fast scintillant, en SPA-perle osv.) Beta-energien vekselvirker med scintillanten og producerer fotoner, som måles af detektoren. 125I frigiver både beta-lignende energi og gammaenergi. Hvis man kun har adgang til en gammatæller, bør man anvende en radioligand mærket med 125I. En yderligere faktor er assayformatet. 125I afgiver mere beta-lignende energi end 3H. Til SPA-assays kan enten 3H- eller 125I-mærkede ligander anvendes effektivt.

Radioaktive ligandbindingsassays kan udføres er flere forskellige formater. Typisk udfører vi dette assay i filtreringsformat, men assayet kan også udføres i SPA-format. SPA-formatet er et homogent format, hvilket betyder, at der ikke er behov for vasketrin. I filtreringsassayet vaskes ubundet ligand væk ved hjælp af en vakuummanifold eller en cellehøstmaskine.

Top

Assayformater

Filtreringsligandbindingsassays

Se flere oplysninger om, hvilke materialer du har brug for, hvilke optimeringer du muligvis skal udføre, og referencer for radioaktive ligandbindingsfilterpladeassays. I filtreringsformat udføres bindingsassayet først i en assayplade og filtreres derefter gennem en filtermåtte eller UniFilter®-plade ved hjælp af en cellehøstmaskine (vakuummanifold). Filtrene vaskes for at fjerne eventuel ubundet radioligand. Filtermat- eller UniFilter-pladen tørres derefter, og der tilsættes scintillationscocktail (eller Meltilex®), inden den aflæses i en passende detektor.

SPA ligandbindingsassays

Se flere oplysninger om, hvilke materialer du skal bruge, hvilke optimeringer du muligvis skal udføre, og referencer for SPA radioligandbindingsassays. I SPA-formatet opfanges cellemembraner på SPA-perler. Når radioliganden binder til receptoren/membranen, bringes det radiokemiske stof i nærheden af SPA-perlen. Beta-energien fra radioliganden kan interagere med scintillanten i perlen, hvilket giver et signal, der kan måles. Radioligand, der ikke er bundet til cellemembranen, vil ikke være tæt nok på SPA-perlen til at interagere kraftigt med scintillanten.

Overblik over ligandbinding

Definitioner

• Affinitet (potens): den tæthed, hvormed liganden binder sig til receptoren. Dette udtrykkes normalt som en ligevægtskonstant, Kd. Jo lavere Kd-værdien er, jo højere affinitet
• Specificitet: beskriver, hvor selektiv en ligand er for en receptor i forhold til andre lignende receptorer
• Kd: Den koncentration, hvor 50 % af receptorerne er besat af radioliganden

Pharmakologiske klassifikationer for ligander

Ligander

• Fuld agonist: en ligand, der binder til og aktiverer en receptor og udløser et maksimalt respons
• Delvis agonist: en ligand, der binder til en receptor og frembringer et submaksimalt respons
• Antagonist: en ligand, der binder til en receptor, men som ikke aktiverer receptoren. Antagonister udløser ingen respons, når de anvendes alene. De blokerer virkningerne af en konkurrerende agonistligand.
• Invers agonist: en ligand, der binder sig til en receptor og mindsker responset under basalniveau

Assays

I. Mætningseksperiment: Måler bindingsligevægt ved at udføre en titrering af radioligand, idet mængden af receptor holdes konstant.

Du kan bruge mætningskurver til at bestemme Bmax (receptorudtryksniveau) og Kd (bindingsaffinitet for ligand).

Mætningseksperiment

• Samlet binding: Stigende koncentration af radioligand i fravær af kold ligand. Måler både specifik binding til receptor og uspecifik binding.
• Uspecifik binding: Stigende koncentration af radioligand i tilstedeværelse af kold ligand. Måler radioligandens binding til ikke-receptorkomponenter.
• Specifik binding: Total minus uspecifik binding. Måler specifik binding til receptoren.

II. Konkurrenceforsøg: Måler ligevægtsbinding af en enkelt koncentration af radioligand i tilstedeværelse af forskellige koncentrationer af umarkeret konkurrent.

Du kan bruge konkurrencekurver til at bestemme affiniteten af et stort antal umarkerede forbindelser for en receptor i screening. IC50 og Ki kan udledes af konkurrencedata.

Konkurrencekurve

• IC50: Koncentration af en konkurrerende ligand, der fortrænger halvdelen af den radioaktive ligand
• Ki: affinitet af en kold ligand for receptoren

Note: Ved ændring af koncentrationen af radioligand kan der observeres en forskydning i IC50 for en referenceforbindelse; Ki forbliver dog den samme.

III. Kinetiske eksperimenter: Mål bindingsniveauet på forskellige tidspunkter for at bestemme hastighedskonstanterne for radioligand-association og -dissociation.

Kinetik

• Mættende koncentration af ligand tilsat en mængde bundet over tid for at bestemme Kon
• Høj koncentration af umarkeret konkurrent tilsat og fald i binding over tid målt for at bestemme Koff

Top

Tips og ofte stillede spørgsmål

Idealt, vil du ønske at vælge en radioligand, der har følgende egenskaber:

• Høj specifik aktivitet (> 20 Ci/mmol for en tritieret ligand)
• Lav uspecifik binding (hydrofobiske ligander vil generelt vise højere uspecifik binding)
• Høj renhed (typisk > 90 % renhed)
• Høj selektivitet
• Stabilitet (hvis du skal bruge din radioligand i en længere periode, kan stabilitet være en faktor. 125I-mærkede ligander bør generelt anvendes inden for en til to måneder efter fremstillingsdatoen. Tritierede ligander bør normalt anvendes inden for 3-6 måneder efter fremstillingsdatoen (der er dog undtagelser herfra).

Når du plotter dine data, anbefaler vi, at du bruger den eksperimentelt bestemte koncentration af dine radioligand-arbejdsopløsninger i stedet for en beregnet koncentration. Nogle radioligander vil klæbe til væggene i dine fortyndingsrør. Det er vigtigt at bestemme den reelle koncentration af din pipetterede radioligand. For eksperimentelt at bestemme koncentrationen af en radioligandfortynding pipetteres et par mikroliter ud af dit fortyndingsrør og dryppes ud på en filtermåtte. Det kan også være ønskeligt at udpodde en 1/10-fortynding af denne prøve, så du kan krydstjekke dine resultater. Bestem dpms (desintegrationer pr. minut). Omregn fra dpms til Curies ved hjælp af følgende ligning:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Nyt derefter den specifikke aktivitet af dit parti radioligand til at omregne fra Curies til mol. For at bestemme den radioaktive koncentration på dette punkt skal du dividere antallet af mol med det volumen, du har spottet på filtermåtten.

FAQs

Q. Hvilken koncentration af radioligand skal jeg bruge til min mætningskurve?
A. Vi anbefaler generelt, at du vælger 3-5 koncentrationer under Kd, og 3-5 koncentrationer over Kd. Den højeste koncentration bør være ti gange Kd.

Q.Hvilken koncentration af radioligand skal vælges til kompetitiv binding?
A. Radioliganden anvendes i en lav koncentration, som regel ved eller under dens Kd-værdi. Hvis den specifikke aktivitet er lav, kan der anvendes en koncentration over Kd-værdien, men den må aldrig være på eller højere end den mættende koncentration.

Q. Hvilken type ligand skal jeg bruge til at bestemme uspecifik binding i mine mætningskurver?
A. Du ønsker normalt at vælge en ligand, der er forskellig fra din radioligand. Du ønsker kun at fortrænge den specifikke binding af radioliganden til receptoren. Du bør vælge en ligand, der har høj affinitet for receptorens bindingssted og lav affinitet for uspecifikke bindingssteder.

Top

Andre PerkinElmer receptor-ligandbindingsteknologier

• DELFIA fluorescerende receptor-ligandbindingsassays

Top

Specifikke radiokemikalier, cellelinjer, Membraner, frosne celler og receptorer

PerkinElmer tilbyder specialfremstillede radiokemikalier, specialfremstillede cellelinjer og membraner, specialfremstillede mikroplader, SPA-perler og FlashPlates samt udvikling af specialfremstillede assays. Hvis du er interesseret i brugerdefinerede tjenester, bedes du kontakte vores brugerdefinerede teams:

ON>POINT® Custom Assay Development Services

Top