Resultater og diskussion
Konstitutiv aktivering af transkriptionsfaktoren NF-κB anses for at være afgørende for B-celle transformation ved API2-MALT1 fusionsprotein af MALT lymfomer med en translokation t(11;18) . Transient overekspression af API2-MALT1 i 293T-celler resulterer i en robust aktivering af et NF-κB luciferase-reportergen , hvilket giver et nyttigt modelsystem til undersøgelse af de mekanismer, hvormed API2-MALT1 signalerer til NF-κB. For at overvåge transfektionseffektiviteten blev pEGFP-N2 (Clontech) medudtrykt i en række eksperimenter. Til vores overraskelse observerede vi, at EGFP hæmmede NF-κB-aktivering induceret af API2-MALT1 på en dosisafhængig måde (Fig 1A). I modsætning hertil påvirkede EGFP ikke reporteraktivering induceret af ekspression af p50/p65-underenhederne af NF-κB (Fig 1B), hvilket tyder på en interferens med NF-κB-signalkaskaden aktiveret af API2-MALT1 opstrøms for NF-κB.
- PowerPoint-dias
- større billede
- større billede
- originalbillede
(A) Aktivering af en NF-κB luciferase-reporter ved et flagmærket API2-MALT1-fusionsprotein hæmmes af EGFP på en dosisafhængig måde.
(B) EGFP blokerer ikke NF-κB-afhængig luciferaseaktivitet induceret af ekspression af p50/p65-underenhederne af NF-κB. (C) Aktivering af en NF-κB luciferase-reporter ved Flag-API2-MALT1 hæmmes af EGFP, der er muteret til TRAF6-bindingsmotivet (D) EGFP, men ikke pmaxGFP, forhindrer TNF-α-induceret aktivering af NF-κB-luciferase-reporteren og fosforylering af IκB-α og JUN i 293T-celler.
EGFP øger ikke HSP70-niveauet eller inducerer HSP70B′ i 293T-celler.
Fluorescensintensiteter (Ex485/Em520nm) for EGFP og pmaxGFP var begge ∼100 gange over baggrundsværdien. (E) N- og/eller C-terminale EGFP-fusionsproteiner (for API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actin, Rab5, Syndecan-bindingsprotein 2 (SDCBP2) eller β-Tubulin) og EGFP med et nukleært lokaliseringssignal (NLS) eller et farnysilationssted (pEGFP-F) reducerer TNF-α-induceret NF-κB luciferase-reporteraktivitet i 293T-celler. Nederst: I mennesker er HSP70 konstitutivt udtrykt under normale forhold, men Hsp70B′ induceres kun som reaktion på stress.
Der er ingen basal ekspression af Hsp70B′.
Som positiv kontrol for HSP70B′-ekspression blev 293T-celler (bane 2) udsat for hedeshock ved 44 °C i to timer (bane 3) og fik lov til at komme sig ved 37 °C i 5 (bane 4) eller 18 (bane 5) timer før høst. NF-κB-afhængig luciferaseaktivitet er for hvert forsøg repræsenteret som foldinduktion af vektortransficerede celler og er repræsenteret grafisk som middelværdi og standardafvigelse for mindst tre uafhængige eksperimenter.
Alle molekylvægtstandarder er i kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 er en væsentlig signaleringskomponent i antigen-receptorvejen mod NF-κB , . Det antages, at BCL10 medierer oligomerisering af MALT1, hvilket muliggør dannelsen af et kompleks med TRAF6. Oligomerisering af TRAF6 fremkalder E3 ubiquitinligaseaktiviteten af dens RING-domæne, hvilket resulterer i modifikation af IKKγ (NEMO) via Lys63-bundne polyubiquitinkæder . Dette letter derefter interaktionen mellem IKKγ og TGFβ-aktiverende kinase 1 (TAK1), som fuldt ud aktiverer IκB-kinase-komplekset (IKK) via fosforylering af IKKβ , hvilket fører til NF-κB-aktivering. På samme måde aktiverer API2-MALT1-fusionsproteinet NF-κB via TRAF6-medieret polyubiquitering af IKKγ , . TRAF6’s interaktion med Carboxy-terminus af MALT1 sker via to potentielle TRAF6-bindingsmotiver (PxExxAr/Ac med Ar/Ac for en aromatisk eller sur rest . Inspektion af EGFP-sekvensen afslørede tilstedeværelsen af en TRAF6-bindingskonsensus (PNEKRD, AA 212-217). Krystalstrukturen af EGFP viser, at PNEKRD-motivet er eksponeret i en løkke mellem to beta-sheets , hvilket tyder på, at det er tilgængeligt, og at EGFP spiller en rolle som negativ regulerende faktor, idet det sekventerer TRAF6. Imidlertid kunne co-IP-eksperimenter ikke påvise en interaktion mellem EGFP og TRAF6 (data ikke vist), og mutanter for TRAF6-bindingskonsensusen blokerede NF-κB-aktivering ved API2-MALT1 lige så effektivt som EGFP (Fig 1C).
For at undersøge, om effekten var begrænset til API2-MALT1, analyserede vi TNF-α-induceret NF-κB-aktivering i 293T-celler, der udtrykker EGFP. Igen reducerede EGFP NF-κB-signalering som vist ved lavere reporteraktivitet og reduceret fosforylering af inhibitoren af NF-κB, IκB-α (Fig. 1D). Dernæst vurderede vi, om EGFP-fusionsproteiner kunne have den samme virkning. Både N- og C-terminale EGFP-fusioner blokerede API2-MALT1- (data ikke vist) og TNFα-induceret NF-κB-aktivering (Fig. 1E). Ud over aktivering af NF-κB-vejen udløser TNF-α-behandling også JNK-signalering. Fosforylering af JUN, der indikerer aktiveret JNK-signalering, reduceres også af EGFP efter TNF-α-behandling (Fig 1D).
Det er blevet rapporteret, at langvarig visualisering af GFP-eksprimerende celler inducerer produktion af reaktive oxygenarter, hvilket kan resultere i fysiologiske ændringer og i sidste ende celledød . Interessant nok havde begge EGFP-mutanter for TRAF6-bindingskonsensus tabt deres grønne fluorescens, men effektivt inhiberede NF-κB-signalering (Fig 1C). Desuden havde pmaxGFP (Amaxa Biosystems), et strukturelt anderledes fluorescerende protein, ingen effekt på NF-κB- og JNK-aktivering ved TNF-α-behandling (Fig. 1D), hvilket tyder på, at hæmningen ikke skyldtes fri-radikale-associeret fototoksicitet. En anden undersøgelse viste, at høje niveauer af EGFP kan inducere heat shock protein 70 (HSP70) , som er i stand til at hæmme NF-κB-aktivering via dets interaktion med IKKγ og TRAF6 . Induktion af HSP70 var imidlertid begrænset til endothelceller, og vi observerede ikke øgede HSP70-niveauer eller induktion af HSP70B′ i EGFP-eksprimerende 293T-celler (Fig 1D-E).
NF-κB-aktivering ved API2-MALT1-ekspression eller ved TNF-α-behandling er forbundet med modifikation af IKKγ med Lys63-linked polyubiquitin af henholdsvis TRAF6 eller TRAF2 , . Endvidere kræver TNFα-induceret JNK-signalering TRAF2 auto-ubiquitinering . For at vurdere en mulig effekt af EGFP på RING E3 ubiquitinligaseaktiviteten af TRAF6 eller TRAF2 overvågede vi ubiquitinering via en HA-tagget ubiquitin-mutant med kun Lys63 tilgængelig for polymerisering (HA-Ub-K63). Ekspression af API2-MALT1 eller TNF-α-stimulering øgede niveauet af polyubiquitinerede proteiner i 293T-celler og var forbundet med øget IKKγ-polyubiquitinering i immunoprecipitater, og begge processer blev blokeret af EGFP (Fig 2A, baner 1,2,5,6). Desuden reducerede EGFP det basale niveau af K63-relateret polyubiquitinering i 293T-celler (Fig. 2A, spor 3 og 4). Tilsvarende stimulerer ekspression af API2-MALT1 eller TNFα-behandling K48-linked ubiquitinkæde samling, som igen blokeres af EGFP og dets strukturelle homolog dsRed (Clontech), men ikke af pmaxGFP (Fig 2B).
- PowerPoint slide
- større billede
- større billede
- originalbillede
(A) 293T-celler transficeret med de angivne konstruktioner og behandlet i 4 timer med 20 ng/ml TNF-α (bane 5 og 6) blev immunoblottet med anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) og anti-EGFP-antistoffer (venstre panel) eller anti-IKKγ-immunopræcipitater blev immunoblottet med anti-Flag (IKKγ) eller anti-HA (ubiquitin) (højre panel).
(B) EGFP påvirker K48-linked polyubiquitination.
293T-celler blev transficeret med et ubiquitinkonstrukt med kun Lys48 tilgængelig for polymerisation (HA-Ub-K48), behandlet i 4 timer med 20 ng/ml TNF-α eller efterladt ubehandlet, og cellelysater blev immunoblottet med anti-HA (Ub-K48) og anti-EGFP-antistoffer.
Fluorescensintensiteterne (Excitation 485/Emission 520 nm) for EGFP og pmaxGFP var sammenlignelige (∼100 gange højere end baggrundsværdierne), ekspression af pDs-Red blev bekræftet ved fluorescensmikroskopi.
(C) EGFP stabiliserer eksogen API2-Myc i 293T-celler via reduktion af dens Lys48-linked auto-ubiquitination og proteasomal nedbrydning.
(D) Stabil ekspression af EGFP i merkelcellekarcinomcellelinjen MCC14.2 reducerer polyubiquitinering og øger de endogene p53-ekspressionsniveauer.
Det gennemsnitlige forhold og standardafvigelse af p53 til actin-signaler er angivet (tre uafhængige eksperimenter), (Ub)n : polyubiquitinerede proteiner.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
For at undersøge, om EGFP udelukkende påvirker ubiquitinering af TRAF-proteiner, evaluerede vi API2, en RING E3 ubiquitinligase, der destabiliserer sig selv via Lys48-linked auto-ubiquitinering . Co-ekspression af EGFP inhiberede polyubiquitination induceret af API2 i 293T-celler, hvilket resulterede i en stigning i API2-ekspressionsniveauerne (Fig 2C). Reducerede steady-state-niveauer af ubiquitination blev også observeret i MCC14.2-celler med stabil ekspression af EGFP. Som følge heraf er basale niveauer af endogent p53, som er stramt reguleret gennem Lys48-koblet ubiquitination af MDM2, let forhøjet i EGFP-udtrykkende celler (Fig 2D).
Næst undersøgte vi, om EGFP påvirker ubiquitination in vivo. De basale niveauer af polyubiquitinering blev reduceret i miltlymfocytter fra EGFP-transgene mus , hvilket var forbundet med reduceret fosforylering af IκB-α efter antigenstimulering sammenlignet med kontrolmus, hvilket indikerer, at EGFP reducerer B-celle receptor-induceret NF-κB-aktivering (Fig 3A-B). API2-MALT1-transgene mus har et underskud af B220+/CD40+ B-celler i deres knoglemarv, da API2-MALT1-medieret NF-κB-aktivering fremskynder deres modning til naive B-celler . Da disse API2-MALT1-transgene mus blev krydset med EGFP-mus, blev underskuddet af B220+/CD40+ B-celler i knoglemarven hos EGFP/API2-MALT1-dobbelttransgene mus (Fig 3C) genoprettet, hvilket yderligere understøtter en indvirkning på ubiquitinering og NF-κB-signalering in vivo. Tilsvarende blev polyubiquitinering reduceret i leverceller fra EGFP-mus og var forbundet med p53-stabilisering, som vist af stigningen i dets ekspressionsniveau (Fig 3A, D). Det vigtigste målgen for p53 ved γ-stråling-induceret DNA-skade i leveren er p21, som er påkrævet for cellecyklusstop og DNA-reparation . Følgelig forårsagede γ-stråleinduceret DNA-skade ikke kun en højere p53-reaktion hos EGFP-musene, men også induktionen af p21 var en smule øget (Fig. 3D). Endelig blev der udført in vitro-eksperimenter for at vurdere, om EGFP direkte påvirker ubiquitinkædesamlingen; rekombinant EGFP påvirkede imidlertid ikke polyubiquitinering af et kontrolsubstrat (Fig 3E), hvilket tyder på en cellekontekstafhængig effekt af EGFP på ubiquitinering.
- PowerPoint slide
- større billede
- større billede
- originalt billede
(A) Western blots af milt- og leverekstrakter fra FVB-wildtype (wt) og EGFP-transgene mus påvist med antistoffer mod Ubiquitin, EGFP og actin (belastningskontrol).
(B) EGFP reducerer fosforylering af IκB-α i anti-IgM/anti-CD40-stimulerede B-lymfocytter oprenset fra EGFP-mus.
Eksperimenter udført i tre eksemplarer, et repræsentativt billede af ét eksperiment er vist.
Gennemsnit og standardafvigelser af forholdet mellem IκB-α-P og actin i forhold til ustimulerede celler er angivet.
(C) Underskuddet af B220+/CD40+ B-celler i knoglemarven hos API2-MALT1-mus genoprettes i EGFP/API2-MALT1-dobbelttransgene mus.
Eksperimenter udført i triplikat, gennemsnittet og standardafvigelserne er vist. eMalt1: endogent Malt1, *a-specifikt bånd (D) EGFP-mus viser forhøjede p53-niveauer i leveren og har forstærket p53/p21-respons ved γ-stråleinduceret DNA-skade.
Gennemsnit og standardafvigelser af forholdet mellem p53/p21- og actinsignalerne i forhold til prøve 1 er angivet.
(E) Rekombinant EGFP (rEGFP) forhindrer ikke polyubiquitinering af et Biotin-Lysozym-substrat in vitro. (Ub)n: polyubiquitinerede proteiner.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
Sammenfattende tyder vores data på, at EGFP og EGFP-fusionsproteiner påvirker RING E3 ubiquitinligase-afhængige processer som NF-κB- og JNK-signalering eller p53-homeostase i cellelinjer og i mus. NF-κB spiller en central rolle i reguleringen af forskellige biologiske processer, herunder medfødt og adaptiv immunitet, udvikling, cellevækst og overlevelse . De prooverlevelsesfremmende signaler skyldes forhøjet ekspression af apoptosehæmmere, såsom B-celle-leukæmi/lymphoma-XL. Derfor kan stigningen i apoptose induceret af EGFP i celler eller i den motoriske cortex og striatum i hjernen hos mus være relateret til nedsat NF-κB-aktivitet på grund af defekt polyubiquitering og aktivering/degradering af dens opstrømsregulatorer. Defekt ubiquitinering er også postuleret som årsag til limb girdle muskeldystrofi, som er forbundet med mutationer i Trim32, en ubiquitinligase for actin . Da EGFP viste sig at forringe actin-myosin-interaktionerne i muskelceller og at fremkalde dilateret kardiomyopati hos EGFP-mus , er det fristende at spekulere i, at actin-ubikvitinering kan spille en væsentlig rolle i normal muskelfunktion, og at dens deregulering med EGFP forårsager de ovennævnte fænotyper. I lyset af den nye rolle, som ubiquitinering spiller i mange cellulære processer, bør brugen af EGFP som en live-celle reporter derfor overvejes nøje.
Skriv et svar