Den oxidativ-fermentative (OF) test blev udviklet af Hugh og Leifson i 1953. De udviklede OF-medier til at skelne mellem oxidative bakterier (som kun producerer syre fra kulhydrater under aerobe forhold) og fermentative bakterier (som producerer syre både under aerobe og anaerobe forhold).
Sakkarolytiske mikroorganismer nedbryder glukose enten fermentativt eller oxidativt. Slutprodukterne af fermenteringen er relativt stærke blandede syrer, som kan påvises i et konventionelt testmedium til fermentering. De syrer, der dannes ved oxidativ nedbrydning af glukose, er imidlertid ekstremt svage og mindre, og det er nødvendigt at anvende det mere følsomme oxidationsfermenteringsmedium efter Hugh og Leifsons OF-medium til detektion. Mediet blev fremstillet ved at øge mængden af glukose i forhold til den mængde, der findes i det medium, der anvendes til påvisning af fermentering, og ved at reducere mængden af pepton.
Hugh og Leifsons OF-medium adskiller sig fra kulhydratfermenteringsmediet på følgende måde:
- Koncentrationen af agar er nedsat fra 3 % til 2 %, hvilket gør det halvfast i konsistensen (dette hjælper med at bestemme organismens motilitet).
- Koncentrationen af pepton er nedsat fra 11 % til 2 %. (hvilket mindsker mængden af alkalisk produkt, der produceres ved metabolisme af pepton; dermed mindskes disse produkters neutraliserende virkning).
- Koncentrationen af kulhydrater øges med 0,5 % til 1.0% (Den øgede koncentration af glukose i mediet øger produktionen af disse svage syrer til et niveau, der kan påvises ved hjælp af bromthymolblå indikator.)
Princip:
Den oxidativt-fermentative test bestemmer, om visse gramnegative stænger metaboliserer glukose ved fermentering eller aerob respiration (oxidativt). Under den anaerobe fermenteringsproces omdannes pyruvat til en række forskellige blandede syrer afhængigt af fermenteringstypen. Den høje koncentration af syre, der produceres under fermentering, vil vende bromthymolblåindikatoren i OF-medier fra grøn til gul i tilstedeværelse eller fravær af ilt .
Visse ikke-fermenterende gramnegative bakterier metaboliserer glukose ved hjælp af aerob respiration og producerer derfor kun en lille mængde svage syrer under glykolyse og Krebs-cyklus. Den mindre mængde pepton og den større mængde glukose gør det lettere at påvise de svage syrer, der således produceres. Der tilsættes dikaliumphosphatbuffer for yderligere at fremme syredetektion.
Anvendelser:
OF Test anvendes til at bestemme, om gramnegative bakterier metaboliserer kulhydrater oxidativt, ved fermentering, eller om de er nonsakkrolytiske (har ingen evne til at udnytte kulhydratet i mediet).
Medie:
Hugh og Leifsons OF-basalmedium; bestanddelene er som følger:
- Natriumchlorid : 5,0 g
- Di-kaliumphosphat : 0,3 g
- Pepton : 2.0 g
- Bromthymolblå:0,03 g
- Agar: 3,0 g
- Glucose : 10 g
- Vand : 1000 ml
Ph-værdien bør justeres til 7,1 inden autoklavering. Efter at mediet er autoklaveret ved 121°C i 15 minutter, tilsættes en filtersteriliseret opløsning af 10% opløsning af kulhydrat aseptisk til mediet til en slutkoncentration på 1%.
Procedure
- Inokulér to rør OF testmedium med testorganismen ved hjælp af en lige tråd ved at stikke “halvvejs til bunden” af røret.
- Dæk det ene rør af hvert par med 1 cm lag steril mineralolie eller flydende paraffin (det skaber anaerobe forhold i røret ved at forhindre diffusion af ilt) og lad det andet rør være åbent for luften.
- Inkubér begge rør ved 35°C i 48 timer (langsomt voksende bakterier kan tage 3-4 dage, før der kan observeres resultater)
Interpretation
Syreproduktion påvises i mediet ved fremkomsten af en gul farve. I tilfælde af oxidative organismer; farveproduktion kan først bemærkes nær mediets overflade.
Følgende er reaktionsmønstrene:
- Gæringsresultat: Syreproduktion på begge (åbne og dækkede) rør. Den producerede syre ændrer pH-indikatoren, bromthymolblå, fra grøn til gul. f.eks. Escherichia coli
- Oxidativt resultat: Syreproduktion i det åbne rør (aerobt) og ikke i det oliedækkede rør (anaerobt) indikerer et oxidativt resultat. Ikke-fermenterende bakterier, der omsætter glukose via oxidativt stofskifte, giver et oxidativt resultat. f.eks. Pseudomonas aeruginosa
- Ikke saccharolytisk (negativt OF-resultat): Ikke-sakrolytiske bakterier giver et negativt OF-resultat. Det negative resultat indikeres ved, at der ikke sker nogen farveændring i det oliedækkede rør og i nogle tilfælde ved en stigning i pH (pH 7,6), hvorved bromthymolblåt ændres fra grønt til blåt i toppen af det åbne rør. Stigningen i pH skyldes aminproduktion fra bakterier, der nedbryder pepton (protein) i mediet.
f.eks. Alcaligenes faecalis.
Kvalitetskontrol
- Glukosegæringsanlæg: Escherichia coli
- Glukoseoxidationsmiddel: Pseudomonas aeruginosa
- Nonsaccharolytisk: Moraxella-arter
Skriv et svar