Nucleolus

Nucleolus er indeholdt i cellekernen.

Nucleolus (plural nucleoli) er et stort, særskilt, kugleformet underafsnit af kernen i eukaryote celler, som er stedet for syntese af ribosomalt RNA (rRNA) og samling af ribosomale underenheder. Nukleoli omtales undertiden som en “ikke-membranøs organel” eller “kerne-membranløs organel” i den bredere betydning af begrebet organel; men nukleoli mangler en membran og er således ikke organeller i den mere tekniske betydning af strukturer, der er separat indesluttet i deres egen lipidemembran. De fleste plante- og dyreceller har en eller flere nukleoler, men nogle celletyper har ingen.

Kerneolien er en meget dynamisk struktur, hvorfra komponenterne spredes ved mitosens begyndelse og samles igen i slutningen af celledelingen. Dette indviklede organ arbejder i samarbejde med andre kernekomponenter for at yde en værdifuld funktion for cellen. Når denne komplekse koordinering i menneskelige celler imidlertid forstyrres, f.eks. ved virusinfektion, medfødte mutationer eller øget aktivitet, kan der opstå adskillige menneskelige sygdomme.

Overblik

Skematisk fremstilling af en typisk dyrecelle, der viser de subcellulære komponenter. Organeller:
(1) nukleolus
(2) kerne
(3) ribosomer (små prikker)
(4) vesikel
(5) groft endoplasmatisk retikulum (ER)
(6) Golgi-apparat
(7) cytoskelet
(8) glat endoplasmatisk retikulum (ER)
(9) mitokondrier
(10) vakuole
(11) cytoplasma
(12) lysosom
(13) centrioler inden for centrosom

Nukleolus er en stor og tydelig kerneformet struktur, der er stærkt organiseret og mangler en membran. Nukleolus’ hovedfunktion er biogenese og samling af ribosomkomponenter (rRNA, ribosomale proteiner). Dette sted for transkription af ribosomal DNA (rDNA) er blevet omtalt som en “ribosomproducerende maskine” (Alberts et al. 1989). Nucleolus kan visualiseres ved hjælp af elektronmikroskopi, mens organisationen og dynamikken kan studeres ved hjælp af Fluorescent Protein Tagging og Fluorescent Recovery after Photobleaching (FRAP).

I en ikke-mitotisk celle, observeret under et lysmikroskop, er nucleolus den mest tydelige struktur i kernen (Alberts et al. 1989). I de indledende faser af celledelingen fragmenteres nukleolerne imidlertid (de kan ikke længere ses i metafase). Ved overgangen mellem telofase og interfase. samles de igen omkring de kromatinområder, hvor rDNA-transkriptionen geninitieres. De rDNA-sekvenser koder for ribosomernes rRNA-molekyler (ribosomalt RNA).

I stedet for at være bundet af en membran synes nucleolus at være opbygget af den specifikke sammenbinding af ufærdige ribosomforløbere, der danner et stort netværk (Alberts et al. 2004). Der kan skelnes mellem tre regioner i en nukleolus: et fibrillært center (som indeholder DNA, der ikke aktivt transskriberes), en tæt fibrillær komponent (indeholder RNA-molekyler, der transskriberes) og en granulær komponent (indeholder modnende ribosomale forløberpartikler) (Alberts et al. 1989). Denne sidste region er med til at gøre grænsen til det omgivende nukleoplasma tydelig, på trods af manglen på en membran.

Da nukleoli udfører produktionen og modningen af ribosomer, findes der et stort antal ribosomer inde i dem. Ud over ribosombiogenese menes nukleoli at have andre roller i den cellulære aktivitet. Ifølge nyere forskning er nucleolus desuden også ansvarlig for trafikken af forskellige fremtrædende små RNA-arter. Nucleolus hjælper dem under deres modningsproces og rute til deres endelige cellulære destination. Selv om nucleoli bliver usynlige under celledeling, har nyere undersøgelser desuden vist, at de er involveret i regulering af cellecyklus. Flere af dens ikke-traditionelle roller omfatter interaktion med virale komponenter, regulering af tumorsuppressor- og onkogenaktiviteter, samling af signalgenkendelsespartikler, modifikation af små RNA-strenge, kontrol af aldring og modulering af telomerasefunktionen.

De tidlige cytologer var så interesserede i de let synlige nukleoler, at en gennemgang fra 1898 opregnede omkring 700 referencer (Alberts et al. 1989). Cytologer påviste i 1940’erne, at nukleoler indeholder høje koncentrationer af RNA og proteiner (Alberts et al. 1989). I 1964 opdagede John Gurdon og Donald Brown cellekerneoli i den afrikanske kløfrø Xenopus laevis. De fandt ud af, at 25 procent af frøæggene ikke havde nogen nukleolus, og at sådanne æg ikke var i stand til at leve. Halvdelen af æggene havde én kerneolus og 25 procent havde to kerneolus. De konkluderede, at nucleolus havde en funktion, der var nødvendig for liv. I 1966 viste Max L. Birnstiel und Hugh Wallace via hybridiseringseksperimenter, at nucleoli koder for ribosomalt DNA.

Morfologi af nucleolus

Nucleoli er typisk sammensat ud af tre morfologisk adskilte regioner, som kan visualiseres ved elektronmikroskopi (EM) (Hernandez-Verdun 2006a; 2006b; Olson og Dundr 2005; Raška et al. 2006; Thiry og Lafontaine 2005; Raška et al. 2006):

1. Fibrillært center (FC):

• lidt farvet ved observation ved EM
• består af “fibriller” (± 50Ǻ i Ø)
• tilstedeværelse af pol I og UBF
• flere FC i en nukleolus
• repræsenterer kun 1-2 procent af det samlede volumen af nukleolus

2. Tæt fibrillært center eller den tætte fibrillære komponent (DFC):

• omkring FC’erne
• består af “tæt pakkede fibriller” (30-50 Ǻ i Ø)
• optager en stor del af nucleolus, ± 17 procent og afspejler groft sagt det nukleolære engagement i ribosombiogenese

3. Granulær region eller granulær komponent (GR):

• region, der omfatter både FC og DFC
• bestående af granula 150-200 Ǻ i Ø
• granulærrig region på grund af tilstedeværelsen af RNP-partikler
• med en fraktion på ca. 75 procent, den optager den største brøkdel af det samlede nukleolusvolumen
• Og selv om nukleolus ikke er membranbundet på grund af tilstedeværelsen af GC, er grænsen til det omgivende kromatin og nukleoplasma normalt tydelig.

En væsentlig (yderligere) bestanddel af nucleolus er kromatin, som trænger ind i organellen fra det omgivende nukleoplasma.

En kontinuerlig forbindelse mellem nukleoplasmaet og de indre dele af nucleolus eksisterer gennem et netværk af nukleolære kanaler. På denne måde fordeles makromolekyler med en molekylvægt på op til 2000 kDa let i hele nucleolus.

En sidste struktur er identificeret inden for nucleolus og betegnes som en nucleolær vacuole. Der findes flere nukleolære vacuoler i nucleolus, men det er fortsat uklart, om de tjener et eller andet funktionelt eller strukturelt formål.

Selv om den “tredelte’ organisation” (FC, DFC, GC) af nucleolus er almindeligt accepteret, er det blevet foreslået, at denne særlige organisation kun er observeret i højere eukaryoter, og at den udviklede sig fra en todelt organisation med overgangen fra anamnioter til amnioter. Som afspejler den betydelige forøgelse af den intergene rDNA-region, ville en oprindelig fibrillær komponent have adskilt sig i FC og DFC (Thiry og Lafontaine 2005).

Nukleolus og rDNA-transkription/rRNA-behandling/ribosomsamling

Nukleolussamlingen sker ikke tilfældigt. Nucleoli dannes omkring specifikke genetiske loci kaldet nucleolar organizing regions (NOR’s). Tidligere beskrevet af McClintock som “det nukleolære organiserende element”, er en NOR sammensat af tandem gentagelser af rRNA gener, der er til stede i flere kopier i hele genomet. Det menneskelige genom indeholder f.eks. mere end 200 kopier af rRNA-genet, og de er samlet på fem forskellige kromosomer. I en typisk eukaryot består et rRNA-gen af en promotor, interne og eksterne transskriberede spacere (ITS/ETS), rRNA-kodningssekvenser (18S, 5,8S, 28S) og en ekstern “ikke” transskriberet spacer (Alberts et al. 2002).

I ribosombiogenesen er der behov for tre eukaryote RNA-polymeraser (pol I, II, III), som fungerer på en koordineret måde. I en indledende fase transskriberes rRNA-generne som en enkelt enhed i nukleolus af RNA pol I. For at denne transkription kan finde sted, er der behov for flere pol I-associerede faktorer og rDNA-specifikke transaktionsfaktorer. I gær er de vigtigste UAF (upstream activating factor), TBP (tata-box binding protein) og CF (core factor), som binder promotorelementer og danner pre-initiationskomplekset (PIC), som igen genkendes af pol I.

I mennesker samles et lignende PIC med SLI, promotorselektivitetsfaktoren, som består af TBP og TBP-associerede faktorer (TAF), IF, transkriptionsinitieringsfaktoren, og UBF, opstrøms bindingsfaktor.

Transskription af ribosomgenet giver et langt forløbermolekyle (45S pre-rRNA), som stadig indeholder den interne transskriberede sapcer (ITS) og den eksterne transskriberede spaced (ETS). Yderligere behandling, som indebærer methylering og endo/exonukleaseaktivitet, er derfor nødvendig for at generere 18S rRNA-, 5,8S- og 28S rRNA-molekylerne. De RNA-modificerende enzymer bringes til deres respektive genkendelsessteder gennem interaktion med guide-RNA’er, som binder disse specifikke sekvenser. Guide-RNA’erne tilhører klassen af små nukleolære RNA’er (snoRNA’er), som er komplekseret med proteiner og eksisterer som små nukleolære-ribonukleoproteinpartikler (RNP) (snoRNP’er)

Når rRNA er behandlet, er rRNA-molekylerne klar til at blive samlet til ribosomer. Et yderligere RNA-molekyle, 5S rRNA, er imidlertid nødvendigt for denne biogenese. I gær er 5S rDNA-sekvensen lokaliseret i den eksterne “ikke” transskriberede spacer og transskriberes i nucleolus af RNA pol III. Hos højere eukaryoter og planter er situationen mere kompleks, for 5S rDNA-sekvensen ligger uden for NOR og transskriberes i nukleoplasmaet, hvorefter den importeres i nucleolus for at deltage i ribosom-samlingen. Denne samling involverer ikke kun rRNA’et, men også ribosomale proteiner. Generne, der koder for disse r-proteiner, transskriberes af pol II i nukleoplasmaet ved hjælp af en “konventionel” proteinsyntesevej (transkription, pre-mRNA-processering, nukleær eksport af modent mRNA og translation på cytoplasmatiske ribosomer). De modne r-proteiner genimporteres derefter til nukleolus. Sammenslutning og modning af rRNA’er og r-proteiner resulterer i dannelsen af ribosomets 40S- og 60S-underenheder. Disse eksporteres gennem de nukleare porekomplekser til cytoplasmaet, hvor de forbliver frie eller vil blive associeret med det endoplasmatiske retikulum (Alberts et al. 2002; Cooper og Hausman 2007).

Nukleolær organisation og dynamik

Flere nukleolære proteiner og små nukleolære RNA’er (snoRNA’er) associeres for at danne det processeringsmaskineri, der er nødvendigt i ribosombiogenesen. De er involveret i modificeringen af de fremspirende rRNA-transskriptioner gennem methylering (2′-O-methylering/pseudouridylering) og endonukleolytisk spaltning af præ-RNA’erne. Disse forarbejdningsstadier er hovedsagelig begrænset til DFC (den tætte fibrillære komponent), hvilket fremgår af tilstedeværelsen af disse snoRNP (små nukleare ribonukleoproteinpartikler), der udgør proteiner, f.eks. fibrillarin, nucleolin og U3-snoRNA. Protein B23 og NOP52, der er involveret i senere faser af behandlingen. er lokaliseret i GC (granulær komponent).

Dette viser, at organiseringen af nucleoli er stærkt reguleret og afhængig af faserne i rRNA-behandlingen. Disse observationer har også ført til den hypotese, at rDNA-transkriptionen må finde sted i FC (fibrillært center) eller i krydset mellem FC og DFC på grund af den vektorielle udadgående bevægelse af præ-RNA-transskriptionerne, mens de behandles for at give modne rRNA’er.

Hvis man betragter det komplette sæt af proteiner og RNA’er, der er nødvendige i ribosombiogenesen, kan man antage, at en nukleolus simpelthen dannes, fordi visse proteiner, der er involveret i transkriptionen af rDNA-generne, binder sig til deres målregioner, og at der rundt omkring dem sker en spontan samling af alle de elementer, der er involveret i modificeringen af de nascente rRNA’er. Derfor sker organiseringen som en konsekvens af ribosombiogenese.

Der er blevet anvendt flere eksperimentelle metoder til at få et detaljeret overblik over denne særlige samlingsproces. De vigtigste er Fluorescent Protein Tagging, hvor et protein af interesse fusioneres med et fluorescerende protein som f.eks. “grønt fluorescerende protein” (GFP), og Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP), som består i at tagge et protein med et fusionsprotein, hvorefter de fluorescerende molekyler i det undersøgte område bleges med en laser. Den fluorescerende intensitet i det undersøgte område vil blive genoprettet på grund af udadgående diffusion af blegede molekyler og indadgående diffusion af ublegede molekyler. Førstnævnte metode gør det muligt at holde styr på bevægelsen af det fluorescerende kompleks (3D+tid), og sidstnævnte metode gør det muligt at måle opholdstiden (tid tilbragt i et bestemt område) for det fluorescerende protein (med andre ord at måle den intracellulære mobilitet).

Både de eksperimentelle metoder er afhængige af evnen til at mærke en lang række nukleolusassocierede proteiner såsom nukleolære proteiner, histoner, DNA-bindingsproteiner, transkriptionsfaktorer og spliceosomer. Ved at spore og måle opholdstiden for de mærkede proteiner kunne man påvise nukleolære proteiners hurtige association/dissociation med andre nukleolære komponenter, den kontinuerlige udveksling af proteiner mellem nukleol og nukleoplasma i interfasen og disse nukleolære proteiners involvering i andre nukleare domæner. Det er f.eks. blevet konstateret, at Cajal-legemer (CB) er beriget med små nukleare og nukleolære ribonukleoproteiner, og at de indeholder flere nukleolært associerede behandlingsproteiner såsom fibrillarin. Derfor er det blevet foreslået, at der skulle eksistere et funktionelt forhold mellem nucleoli og Cajallegemer (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Flere eksperimentelle observationer tyder på, at rekrutteringen af de elementer, der udgør nucleolus, sker ikke tilfældigt, og at den reguleres af cellecyklusens progression. Under mitose forbliver transkriptionsmaskineriet tæt forbundet med rDNA’et. Transkriptionen undertrykkes imidlertid af proteinkinasekomplekset cyclin B/Cdk1 (PMF). Dette kompleks aktiveres ved mitosens begyndelse og undertrykker nukleare aktiviteter ved at fosforylering af en række proteinkinaser eller strukturelle proteiner, der er involveret i de cellulære omlægninger, der er nødvendige for en korrekt celledeling. Det er i slutningen af mitosen, når PMF nedbrydes gennem proteolytisk spaltning af cyklin B, at nukleolierne samles igen omkring rDNA-stederne som reaktion på genindledningen af rDNA-transskriptionen. Nukleolærproteinerne er i modsætning til de proteiner, der er involveret i transkriptionen, lokaliseret ved kromosomernes periferi i cellecyklussens M-fase. Dette kan visualiseres ved hjælp af fluorescerende proteinmærkning. Ved overgangen fra telofase til G1 er størstedelen af dem grupperet i prænukleolære legemer (PNB). Det er disse PNB, der udfører translokationen fra kromosomerne til de steder, hvor rDNA-transkriptionen er begyndt. PNB’erne menes at fungere som en samlingsplatform og som reservoir for proteinkomplekser, som frigiver processeringsproteinerne på de steder, hvor rDNA-transskriptionen finder sted. Tidlige processeringsproteiner, såsom fibrillarin, rekrutteres som reaktion på et fald i cyclin B/Cdk1-aktiviteten, mens sene processeringsproteiner, såsom B23 og Nop52, rekrutteres som reaktion på cyclinafhængig kinase (cdk)-aktivitet. På denne måde kan de forskellige processeringsproteiner frigives præcis på det tidspunkt, hvor de er nødvendige under rRNA-syntesen (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Menneskelige sygdomme forbundet med nukleolus

Menneskelige sygdomme forbundet med en funktionsfejl i nukleolus kan skyldes virusinfektioner, øget nukleolær aktivitet eller blot medfødte mutationer, der påvirker de nukleolære proteiner.

Hvis en virus indeholder et nukleolært målretningssignal (NOS) i sit genom, vil nogle viruspartikler blive rettet mod nukleolus. Det er tilfældet med det humane immundefektvirus (HIV), som dirigerer HIV-1 Rev-proteinet til kerneolien. Gennem interaktion med det nukleolære B23-protein tjener det sit formål ved at regulere splejsmønstret for HIV-1 mRNA’et, for det fremmer eksporten af usplejset mRNA til cytoplasmaet. Det er blevet foreslået, at Rev-proteinet er lokaliseret i nucleolus for at tilvejebringe en alternativ translokationsvej for viralt (uspliced/delvist spliced) mRNA fra nucleoplasmaet til cytoplasmaet. På denne måde beskyttes det virale mRNA mod nedbrydning (som normalt ville finde sted for at beskytte cellen mod oversættelse af præ(ubehandlet)-mRNA).

En øget nukleolær aktivitet vil have en effekt på overproduktionen af ribosomer, hvilket i sidste ende vil føre til tumorgenese og kræft. En nøglefaktor i disse dysfunktionelle nukleoler er proteinet c-myc, der er et produkt af c-myc-proto-oncogenet. Det stimulerer ribosombiogenesen ved direkte regulering af pol I, ved at påvirke transkriptionen af pol II, III og ved at associere med SL1-komponenten i præinitiationskomplekset, hvilket øger effektiviteten af rekrutteringen af pol I til præinitiationskomplekset.

Der er desuden beskrevet flere medfødte mutationer, der påvirker nukleolære proteiner: Weine syndrom, Treacher Collins syndrom og dyskeratosis congenital syndrome (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b; Raška et al. 2006).

Nucleolar dominans

Nucleolar dominans er også blevet påvist for rRNA-gener. I nogle organismer, især planter, kan den udviklende organisme, når to kerner kombineres til en enkelt celle under hybridisering, “vælge” et sæt rRNA-gener til transkription, når to kerner kombineres til en enkelt celle. Den anden forælders rRNA-gener undertrykkes og transskriberes normalt ikke, selv om der lejlighedsvis kan forekomme reaktivering af de undertrykte eller “ringere” rRNA-gener. Denne selektive præference for transkription af rRNA-gener betegnes nukleolær dominans.

• Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts og J. D. Watson. Molecular Biology of the Cell, 2. udgave. New York: Garland Publishing, 1989. ISBN 0824036956.

• Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, og P. Walter. 2002. Molecular Biology of the Cell, 4. udgave. New York: Garland Science. ISBN 0815332181.

• Cooper, G. M., og R. E. Hausman. 2007. The Cell: A Molecular Approach. Washington, DC: ASM Press. ISBN 978087893232191.

• Hernandez-Verdun, D. 2006a. [http://www.springerlink.com/content/75n545v0g3186830 Nucleolus: Fra struktur til dynamik. Histochem Cell Biol 125: 127-137. Hentet den 8. juli 2008.

• Hernandez-Verdun, D. 2006b. The nucleolus: En model for organiseringen af nukleare funktioner. Histochem Cell Biol 126: 135-148. Hentet den 8. juli 2008.

• Khadzhiolov, A. A. 1985. Nucleolus og ribosombiogenese. Wien: Springer-Verlag. ISBN 3211817905.

• Olson, M. O. J. 2004. The Nucleolus. Georgetown, TX: Landes Bioscience/ Eurekah.Com. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers. ISBN 0306478730.

• Olson, M. O. J., og M. Dundr. 2005. De bevægelige dele af nucleolus. Histochem Cell Biol 123: 203-216. Hentet den 8. juli 2008.

• Raška, I., P. J. Shaw og D. Cmarko. 2006. Ny indsigt i nukleolær arkitektur og aktivitet. International Review of Cytology 255: 177-235. Hentet den 23. juli 2008.

• Thiry, M., og L. J. Lafontaine. 2005. Fødsel af en kerneolus: Udviklingen af nukleolære rum. Trends in Cell Biology 15 (4). Hentet den 8. juli 2008.

• Thiry, M., og G. Goessens. 1996. Nucleolus under cellecyklusen. New York: Springer; Austin, TX: R.G. Landes. ISBN 3540613528.

Alle links hentet 14. december 2018.

• Nucleolus under elektronmikroskopet II.

Acrosom | Kloroplast | Cilium/Flagellum | Centriole | Endoplasmatisk retikulum | Golgi-apparat | Lysosom | Melanosom | Mitokondrion | Myofibril | Kerne | Parenthesom | Peroxisom | Plastid | Ribosom | Vacuole | Vesikel