Valg af passende restriktionsenzymer baseret på definerede kriterier
For at gå videre med et kortfattet eksempel blev tdTomato fluorescerende protein klonet ind i en alfaretroviral vektor. Efterfølgende blev der genereret en murin leukæmicellinje, der udtrykker tdTomato. Denne cellelinje vil blive anvendt til at spore tumorceller efter injektion i mus i prækliniske immunoterapistudier. Denne kloningsmetode kan dog anvendes til ethvert andet gen. For at påbegynde kloningsprojektet skal genet af interesse (GOI) analyseres. Først kontrolleres det, om vores annoterede sekvens har en startkodon (ATG, den mest almindelige startkodon) og en af de tre stopkodoner (TAA, TAG, TGA). Hvis genet tidligere er blevet manipuleret eller fusioneret med et andet gen (f.eks. via en 2A-sekvens), sker det, at et gen af interesse måske ikke har et stopkodon. I sådanne tilfælde skal der tilføjes et stopkodon i slutningen af din annoterede sekvens. Det er også en fordel at undersøge, om din GOI indeholder en åben læseramme (ORF). Dette er vigtigt, da hyppig manipulation af sekvenser enten ved hjælp af software eller via kloning fejlagtigt kan tilføje eller slette nukleotider. Vi bruger Clone Manager-software (SciEd) til at finde ORF’er i vores plasmidsekvenser; der findes dog flere gratis websteder, som du kan bruge til at finde ORF’er, herunder NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
Det tdTomato-gen, der indeholder ATG-startkodon og TAA-stopkodon (figur 1). Størrelsen af tdTomato-genet er 716 bp.
Oversigt over starten og slutningen af det pågældende gen. (A) Nukleotidsekvenserne i starten og slutningen af tdTomato-genet er vist. De kodende strengnukleotider er angivet med fed skrift (B) Nukleotidsekvenserne af fremad- og omvendte primere, der indeholder de rette restriktionsenzymsteder og Kozak-sekvensen, er vist.
I næste trin skal der udformes PCR-primere, der indeholder de rette restriktionsenzymsteder, til amplifikation af GOI. Der bør tages hensyn til flere kriterier for at vælge de optimale restriktionsenzymer. For det første skal bindingsstederne for restriktionsenzymerne helst være til rådighed på et kloningssted med flere kloningssteder i vektoren. Alternativt kan de være placeret nedstrøms for promotoren i din vektorsekvens. Restriktionsenzymerne bør være single cutters (single cutters er kun rettet mod ét restriktionssted i en DNA-sekvens) (figur 2A). Hvis de er dobbelte eller multiple cutters, skal de skære i en sekvens, der ikke er nødvendig for vektorplasmidets korrekte funktion, og de vil i sidste ende blive fjernet (figur 2B). Det er også muligt at vælge et dobbelt cutter- eller multiple cutter-enzym, der skærer vektoren nedstrøms for promotoren og heller ikke inden for en vigtig sekvens i plasmidet (figur 2C). Dobbeltcutter- eller multiple cutter-enzymer har henholdsvis to eller flere restriktionssteder på en DNA-sekvens. Ved at skære vektoren med dobbelt- eller multiple cutters vil der opstå to identiske ender. I så fald skal indsætningskassetten også indeholde de samme restriktionsenzymsteder i begge ender. Når insert- og vektorfragmenterne blandes i et ligationsforsøg, kan insertet derfor fusionere med vektoren enten i den rigtige retning (fra startkodon til stopkodon) eller i omvendt retning (fra stopkodon til startkodon). Et tredje scenarie kan opstå, hvis vektorfragmentet danner en selvligerende cirkel, hvor indsatsen slet ikke indgår. Når DNA’et er blevet inkuberet med restriktionsenzymer, vil affosforylering af 5′- og 3′-enden af vektorplasmidet ved hjælp af et alkalisk fosfataseenzym i høj grad reducere risikoen for selvligering. Det er derfor vigtigt at screene et kloningsprodukt for disse tre produkter (højre orientering, omvendt orientering, selvligering) efter fragmentligering.
Valg af de rette restriktionsenzymer på grundlag af definerede kriterier for PCR-kloning. (A) To enkeltskærende restriktionsenzymer (E1 og E2) er placeret nedstrøms for promotoren. (B) Restriktionsenzymerne E1 og E2 skærer plasmidet nedstrøms for promotoren flere gange (her to gange for hvert enzym). (C) Restriktionsenzym E1 skærer plasmidet nedstrøms for promotoren mere end én gang. (D) PCR-produktet, som indeholder tdTomato-genet og restriktionsenzymstederne, blev kørt på en gel, inden det blev ekstraheret til downstream-applikationer.
For det andet er det på grund af højere kloningseffektivitet ved brug af klæbende DNA-fragmenter ønskeligt, at mindst ét (bedre begge) af restriktionsenzymerne er en såkaldt klæbende klipper. Sticky end cutters kløver DNA asymmetrisk og genererer komplementære kohæsive ender. I modsætning hertil skærer blunt end cutters sekvensen symmetrisk og efterlader ingen overhængende dele. Kloning af blunt-end-fragmenter er vanskeligere. Ikke desto mindre kan valg af et højere molforhold mellem insert og vektor (5 eller mere) og anvendelse af 10 % polyethylenglycol (PEG) forbedre ligeringen af blunt-end-fragmenter.
For det tredje skærer nogle restriktionsenzymer ikke methyleret DNA. De fleste E. coli-stammer indeholder Dam- eller Dcm-methylaser, der methylerer DNA-sekvenser. Dette gør dem resistente over for methyleringsfølsomme restriktionsenzymer. Da vektor-DNA for det meste fremstilles i E. coli, vil det være methyleret. Det er derfor ønskeligt at undgå methyleringsfølsomme restriktionsenzymer; nogle gange er isoschizomeren af et methyleringsfølsomt restriktionsenzym imidlertid resistent over for methylering. F.eks. er Acc65I-enzymet følsomt, mens dets isoschizomer kpnI er resistent over for methylering. Isoschizomere er restriktionsenzymerer, der genkender de samme nukleotidsekvenser. Hvis der ikke er andre muligheder end at anvende methyleringsfølsomme restriktionsenzymer, skal vektor-DNA’et fremstilles i dam – dcm – E. coli-stammer. En liste over disse stammer og også almindelige E. coli-værtsstammer til molekylær kloning er opsummeret i tabel 1. Oplysninger om restriktionsenzymernes methyleringsfølsomhed gives normalt af producenten.
For det fjerde gør det kloningen lettere, hvis den buffer, der er nødvendig for restriktionsenzymernes fulde funktionalitet, er den samme, fordi man kan udføre dobbelt restriktionsdigestning. Det sparer tid og reducerer DNA-tabet under oprensning. Det kan ske, at et af restriktionsenzymerne er aktivt i en buffer, mens det andet enzym er aktivt i dobbelt så høj koncentration af den samme buffer. F.eks. er NheI-enzymet fra Thermo Scientific aktivt i Tango 1X-buffer (Thermo Scientific), og EcoR1-enzymet er aktivt i Tango 2X-buffer (Thermo Scientific). I sådanne tilfælde skal plasmid-DNA’et først fordøjes med det enzym, der kræver den højere koncentration i bufferen (her EcoR1). Herefter fortyndes bufferen til det næste enzym (der kræver en lavere koncentration (her NheI)) i samme buffer. Med fremkomsten af universelle buffere er det imidlertid blevet lettere at foretage dobbelt fordøjelsen af DNA-sekvenser. I vores eksempel indeholder vektoren AgeI- og SalI-restriktionsstederne. Disse enzymsteder blev brugt til at udforme PCR-primere (figur 1). For at restriktionsenzymfordøjelsen kan foregå korrekt, er det vigtigt, at plasmidrenheden er høj. DNA-absorptionen, som måles med et spektrofotometer, kan anvendes til at bestemme renheden efter rensning. DNA, proteiner og opløsningsmidler absorberes ved henholdsvis 260 nm, 280 nm og 230 nm. Et OD 260/280-forhold på >1,8 og et OD 260/230-forhold på 2 til 2,2 anses for at være rent for DNA-prøver. OD 260/280- og 260/230-forholdet for vores eksemplariske plasmidpræparater var henholdsvis 1,89 og 2,22. Vi observerede, at renheden af de gelekstraherede vektor- og insert-DNA-fragmenter var lavere efter restriktionsdigestring; ligationen fungerer selv i sådanne tilfælde, men der kan forventes bedre resultater ved brug af fragmenter med høj renhed.
Følgende websted for plasmidrepositoriet kan være nyttigt til udvælgelse af forskellige vektorer (viral ekspression og pakning, tomme backbones, fluorescerende proteiner, inducerbare vektorer, epitopmærker, fusionsproteiner, reportergener, artsspecifikke ekspressionssystemer, selektionsmarkører, promotorer, shRNA-ekspression og genomteknik):http://www.addgene.org/browse/.
En samling af kloningsvektorer af E. coli er tilgængelig på følgende websted:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Design af kloningsprimere baseret på definerede kriterier
Til design af PCR-primere skal du kontrollere start- og stopkodonerne i din GOI. Find sekvensen af de ønskede restriktionsenzymer (findes på producenternes websteder) til den fremadrettede primer (figur 3A). Den skal være placeret før GOI (figur 1B). Den såkaldte Kozak-sekvens findes i eukaryote mRNA’er og forbedrer initieringen af translation. Det er fordelagtigt at tilføje Kozak-sekvensen (GCCACC) før ATG-startkodonet, da den øger translationen og ekspressionen af det pågældende protein i eukaryoter. Derfor indsatte vi GCCACCC umiddelbart efter restriktionsenzymsekvensen AgeI og før ATG-startkodonet. Derefter tilføjes de første 18-30 nukleotider af GOI fra ATG-startkodonet til den fremadrettede primersekvens. Disse overlappende nukleotider, der binder sig til skabelon-DNA’et, bestemmer annealingstemperaturen (Tm). Sidstnævnte er normalt højere end 60 °C. Her anvender vi Phusion high-fidelity DNA-polymerase (Thermo Scientific). Du kan bruge følgende websteder til bestemmelse af den optimale Tm:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Udformning af primere baseret på definerede kriterier for PCR-kloning. (A-B) Sekvenserne af den fremadrettede og den omvendte primer er afbildet. Enden af den kodende streng skal omdannes til det omvendte komplementformat med henblik på design af den omvendte primer. Yderligere oplysninger findes i teksten.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
Tm for vores fremadrettede primer er 66 °C.
Vælg de sidste 18 til 30 nukleotider, herunder stopkodonet i din GOI, til design af den omvendte primer (figur 3B). Beregn derefter Tm for denne sekvens, som skal ligge over 60 °C og tæt på Tm for den fremadrettede primer. Tm for den overlappende sekvens af vores omvendte primer var 68 °C. Derefter tilføjes målsekvensen for det andet restriktionsenzymsted (i dette tilfælde SalI) umiddelbart efter stopkodonet. Endelig konverteres denne sammensatte sekvens til en omvendt komplementær sekvens. Følgende websteder kan bruges til at bestemme sekvensen af den omvendte primer:
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis er vigtig, da den omvendte primer binder den kodende streng, og derfor skal dens sekvens (5′ → 3′) være omvendt komplementær i forhold til sekvensen af den kodende streng (figur 1A).
Udførelse af PCR ved hjælp af proofreading-polymeraser
Da PCR-reaktionen følger logaritmisk amplifikation af målsekvensen, vil enhver replikationsfejl i løbet af denne proces blive amplificeret. Fejlfrekvensen for ikke-proofreading DNA-polymeraser, såsom Taq-polymerase, er ca. 8 × 10-6 fejl/bp/PCR-cyklus; proofreading-enzymer, såsom Phusion-polymerase, har imidlertid en rapporteret fejlfrekvens på 4,4 × 10-7 fejl/bp/PCR-cyklus. På grund af dens overlegne nøjagtighed og processivitet blev Phusion-DNA-polymerase anvendt i dette eksempel. Det skal bemærkes, at Phusion har andre temperaturkrav end andre DNA-polymeraser. Primer Tm for Phusion er beregnet på grundlag af Breslauer-metoden og er højere end Tm ved brug af Taq- eller pfu-polymeraser. For at opnå optimale resultater bør Tm beregnes på grundlag af de oplysninger, der findes på enzymleverandørernes websted. På grund af den højere hastighed for Phusion er 15-30 sekunder desuden normalt nok til at amplificere hver kb af den pågældende sekvens.
Efter PCR’en skal produktet lægges på en gel (figur 2D). Det tilsvarende bånd skal skæres over, og DNA’et skal ekstraheres. Det er vigtigt at sekventere PCR-produktet, da PCR-produktet kan indeholde mutationer. Der findes flere PCR-kloneringskits, hvoraf nogle er vist i tabel 2. Vi har anvendt kloningsvektoren pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, patentpublikation: US 2009/0042249 A1, Genbank-adgangsnummer EF694056.1) og klonede PCR-produktet ind i den lineariserede vektor. Denne vektor indeholder et dødeligt gen (eco47IR), som aktiveres, hvis vektoren bliver cirkulæriseret. Hvis PCR-produktet imidlertid klones ind i kloningsstedet inden for det dødelige gen, afbrydes sidstnævnte, så bakterierne kan danne kolonier ved transformation. Cirkulæriserede vektorer, der ikke indeholder PCR-produktet, udtrykker det giftige gen, som derfor dræber bakterierne og forhindrer dannelsen af kolonier. Bakteriekloner skal derefter dyrkes, plasmid-DNA isoleres og sekventeres. Kvaliteten af det isolerede plasmid er afgørende for optimale sekventeringsresultater. Vi isolerede plasmid-DNA fra i alt 1,5 ml dyrkede bakterier (udbytte 6 μg DNA; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) ved hjælp af et miniplasmid-præparationssæt (QIAGEN). Hele PCR-processen, herunder kloning af PCR-produktet til sekventeringsvektoren og transfektion af bakterier med sekventeringsvektoren, kan gennemføres på én dag. Den næste dag dyrkes bakterieklonerne natten over, inden de sendes til sekventering.
Analyse af sekventeringsdata
Sekventeringsfirmaer rapporterer normalt sekventeringsdata som en FASTA-fil og også som færdige nukleotidsekvenser via e-mail. Til sekvensanalyse kan følgende websteder anvendes:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Her vil vi fokusere på det første websted. På denne webside klikker du på “nucleotide blast”-indstillingen (figur 4A). Et nyt vindue åbnes. Som standard er indstillingen “blastn” (blast nucleotide sequences) markeret (figur 4B). Herefter markeres afkrydsningsfeltet bag “Align two or more sequences”. Nu vises to bokse. I boksen “Enter Query Sequence” (den øverste boks) indsætter du den ønskede sekvens af dit gen af interesse, som er flankeret af de restriktionssteder, du allerede har designet til dine PCR-primere. I feltet “Enter Subject Sequence” (det nederste felt) skal du indtaste sekvensen eller uploade den FASTA-fil, du har modtaget fra sekventeringsfirmaet. Klik derefter på “BLAST”-knappen nederst på siden. Efter et par sekunder vil resultaterne blive vist på en anden side. En del af tilpasningsdataene er vist i figur 4C. Ved fortolkningen bør følgende punkter tages i betragtning: 1) antallet af identiske nukleotider (vist under punktet “Identities”) skal være lig med nukleotidnummeret for dit gen af interesse. I vores eksempel var antallet af nukleotider i tdTomato-genet sammen med antallet af nukleotider for restriktionsenzymstederne og Kozak-sekvensen 735. Dette svarer til det indberettede antal (figur 4C). 2) Sekvensidentiteten (under punktet “Identities”) skal være 100 %. Lejlighedsvis er sekvensidentiteten 100 %, men antallet af identiske nukleotider er lavere end forventet. Dette kan ske, hvis en eller flere af de oprindelige nukleotider er fraværende. Husk, at alle sekventeringsteknologier har en fejlprocent. For Sanger-sekventering er denne fejlprocent rapporteret til at ligge mellem 0,001 % og 1 %. Nukleotid-substitution, -deletion eller -indsættelse kan identificeres ved at analysere sekventeringsresultaterne. Hvis sekvensidentiteten ikke når op på 100 %, bør plasmidet derfor sekventeres på ny for at skelne mellem PCR-fejl og simple sekventeringsfejl. 3) Gaps (under punktet “Gaps”) bør ikke være til stede. Hvis der opstår huller, bør plasmidet resekventeres.
Sekvensanalyse af PCR-produktet ved hjælp af NCBI BLAST-platformen. (A) På NCBI BLAST-websiden er indstillingen “nucleotide blast” valgt (markeret med den ovale linje). (B) Indstillingen “blastn” vises som standard (markeret med cirklen). Sekvensen af det pågældende gen (flankeret af restriktionsstederne som tidligere designet til PCR-primerne) og PCR-produktet skal indsættes i felterne “Enter Query Sequence” og “Enter Subject Sequence”. Sekvenser kan også uploades som FASTA-filer. (C) Nukleotidjustering af de første 60 nukleotider er vist. To vigtige elementer for sekvensanalysen er markeret med ovale linjer.
Den gennemsnitlige længde af en læsning, eller læselængde, er mindst 800 til 900 nukleotider ved Sanger-sekventering. For pJET-vektoren skal der anvendes en fremadrettet og en omvendt primer til sekventering af det komplette gen. Disse primere kan normalt dække en genstørrelse på op til 1800 bp. Hvis genets størrelse er større end 1800, skal der designes en ekstra primer for hver 800 ekstra nukleotider. Da pålidelig base calling ikke starter umiddelbart efter primeren, men ca. 45-55 nukleotider nedstrøms for primeren, bør den næste fremadrettede primer designes til at starte efter ca. 700 nukleotider fra genets begyndelse. Forskellige websteder, herunder følgende, kan anvendes til at designe disse primere:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Med en længde på 735 bp lå størrelsen af PCR-produktet i dette eksempel godt inden for pJET-sekventeringsprimernes rækkevidde.
Efter valg af den sekvensverificerede klon blev vektor- og insertplasmiderne fordøjet med restriktionsenzymerne AgeI og SalI (figur 5). Dette blev efterfulgt af gelrensning og ligation af fragmenterne. Transformation af kompetent E. coli med ligationsblandingen gav flere kloner, som blev screenet med restriktionsenzymer. Vi vurderede otte kloner, som alle indeholdt tdTomatoindsatsen (figur 6). Det er vigtigt at vælge kloner, der er store. Satellitkloner har måske ikke det rigtige konstrukt. Vi brugte et hurtigt plasmid-mini-præparationssæt (Zymo Research) til at ekstrahere plasmidet fra 0,6 ml bakteriesuspension. Udbyttet og renheden var tilfredsstillende for restriktionsenzymbaseret screening (2,3 μg DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). Til plasmidoprensning i stor skala blev der anvendt et maxi-præparationssæt (QIAGEN) til at ekstrahere plasmidet fra 450 ml bakteriekultur (udbytte 787 μg DNA; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). Det forventede udbytte af en pBR322-afledt plasmidisolering fra 1,5 ml og 500 ml bakteriekultur er henholdsvis ca. 2-5 μg og 500-4000 μg DNA.
Vektor- og insertplasmidkort A) Illustration af CloneJET-plasmidet indeholdende PCR-produktet. Indsættelse af PCR-produktet i plasmidets kloningssted forstyrrer integriteten af det giftige gen eco47IR og muliggør vækst af transgenpositive kloner. Plasmidet blev skåret med enzymerne AgeI og SalI, hvorved der blev dannet to fragmenter på henholdsvis 3 kb og 0,7 kb. Fragmentet på 0,7 kb (tdTomato-genet) blev anvendt som insert til kloning. (B) Illustration af vektorplasmidet. Plasmidet blev skåret med enzymerne AgeI og SalI, hvorved der blev dannet to fragmenter på 4,9 kb og 0,7 kb. Fragmentet på 4,9 kb blev anvendt som vektor til kloning. AMP: Ampicillinresistensgen; PRE: posttranskriptionelt reguleringselement; MPSV: promotor for myeloproliferativt sarkomvirus.
Screening af det endelige plasmid med restriktionsenzymer. Illustration af det endelige plasmid er vist. Til screening blev plasmidet skåret med BsiwI-enzymet, hvorved der blev genereret to fragmenter på 4,8 kb og 0,8 kb i størrelse. AMP: Ampicillinresistensgen; PRE: posttranskriptionelt regulatorisk element; MPSV: promotor for myeloproliferativt sarkomvirus.
Nogle plasmider har en tendens til at rekombineres i den bakterielle vært, hvilket skaber insertioner, deletioner og rekombinationer. I disse tilfælde kan det være nyttigt at anvende en recA-deficient E. coli (tabel 1). Hvis GOI’en er giftig, kan inkubering af bakterier ved lavere temperaturer (25-30 °C) og anvendelse af ABLE C- eller ABLE K-stammer desuden omgå problemet.
Viral produktion og transduktion af målceller
For at undersøge in vitro-ekspressionen af det klonede gen blev HEK293T-celler transficeret med plasmider, der koder for tdTomato-genet, alfaretroviral Gag/Pol og vesikulær stomatitisvirus-glykoprotein- (VSVG-) envelope. Disse celler, som stammer fra menneskelige embryonale nyrer, er lette at dyrke og let transficerbare. Derfor anvendes de i vid udstrækning inden for bioteknologi og genterapi til at generere virale partikler. HEK293T-celler skal deles hver anden dag med varmt medium. De bør ikke nå 100 % konfluens for at opnå optimale resultater. For at opnå en god transfektionseffektivitet skal disse celler dyrkes i mindst en uge for at få dem i logfase. Transfektionseffektiviteten var 22 %, som bestemt på grundlag af ekspressionen af tdTomato ved fluorescensmikroskopi 24 timer senere (figur 7A-B). For at generere en murin leukæmicellinje, der udtrykker tdTomato-genet til immunoterapistudier, blev C1498 leukæmiceller transduceret med friskhøstet virus (36 timer efter transfektion). Billeddannelsesundersøgelser (figur 7C) og flowcytometrisk analyse (figur 7D) fire dage efter transduktionen bekræftede ekspressionen af tdTomato i størstedelen af cellerne.
Vurdering af in vitro-ekspression af det klonede gen. (A, B) HEK293T-celler blev transficeret med Gag/Pol-, VSVG- og tdTomato-plasmider. Ekspressionen af tdTomato-genet blev vurderet ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Fluorescensbilleder blev overlejret et bright-field-billede med henblik på differentiering af positivt transducerede celler. Transfektionseffektiviteten blev bestemt på grundlag af ekspressionen af tdTomato efter 24 timer. Ikke-transficerede HEK293T-celler blev anvendt som kontrolceller (blåt histogram). (C, D) Den murine leukæmicellinje C1498 blev transduceret med frisk virus. Fire dage senere blev transgenekspression vurderet ved fluorescensmikroskopi (C) og flowcytometri (D). Ikke-transducerede C1498-celler blev anvendt som kontrolceller (blåt histogram). Skalaen repræsenterer 30 μm.
Skriv et svar