Molekylær identifikation af Mycobacterium-arter af folkesundhedsmæssig og veterinær betydning fra kvæg i den sydlige delstat México

Abstract

Mycobacterium-genus forårsager en række zoonotiske sygdomme. Det bedst kendte eksempel er den zoonotiske tuberkulose forårsaget af M. bovis. Der er langt mindre viden om “ikke-tuberkuløse mykobakterier (NTM)”, som også er forbundet med infektioner hos mennesker. Den mexicanske standard NOM-ZOO-031-1995 regulerer tilstedeværelsen af M. bovis hos kvæg; der findes imidlertid ingen regler for NTM-arter. Formålet med denne undersøgelse var at isolere og identificere ikke-tuberkuløse mykobakteriearter fra kvæg fra lokale besætninger i den sydlige del af staten Mexico gennem identifikation og påvisning af den molekylære markør på 100 bp i 23S rRNA-genet med efterfølgende sekventering af 16S rRNA-genet. Der blev indsamlet mælkeprøver (35) og nasale eksudatprøver (68). Af de 108 isolerede stammer blev 39 udvalgt til identifikation. Tretten stammer isoleret fra nasale exudater forstærkede den molekylære markør på 100 bp og blev identificeret som M. neoaurum (seks stammer), M. parafortuitum (fire stammer), M. moriokaense (to stammer) og M. confluentis (en stamme). Bortset fra M. parafortuitum er de andre identificerede arter af betydning for folkesundheden og veterinærsektoren, fordi de er patogene for mennesker, især dem med underliggende medicinske tilstande.

1. Indledning

Slægten Mycobacterium forårsager en lang række zoonotiske sygdomme. Det bedst kendte eksempel er zoonotisk tuberkulose forårsaget af M. bovis, for hvilken kvæg er det vigtigste reservoir. M. bovis er en del af “tuberkulosekomplekset”, som også omfatter arterne M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae og M. microti .

Inden for mykobakteriegruppen findes de “ikke-tuberkuløse mykobakterier (NTM)”, som også er forbundet med infektioner hos mennesker. NTM findes i forskellige miljøkilder såsom jord, vand, vegetation, dyr, mejeriprodukter og afføring og kan overføres utilsigtet ved indånding, indtagelse eller hudpenetration .

Den mexicanske standard NOM-ZOO-031-1995 regulerer tilstedeværelsen af M. bovis hos kvæg for at kontrollere og udrydde bovin tuberkulose (bTB); der findes imidlertid ingen regulering for NTM-arter. Den officielle diagnose af kvægtuberkulose som følge af tilstedeværelsen af M. bovis i marken er baseret på en intradermal test med et renset proteinderivat (tuberkulin) . Selv om denne test har været anvendt i flere år, giver den ikke god følsomhed og specificitet. Ca. 20 % af dyrene med tuberkulose reagerer ikke på testen , og tilstedeværelsen af andre mykobakteriearter, både tuberkulosekomplekset og NTM-arter, forårsager interferens, der fører til falsk-positive og falsk-negative diagnoser.

Selv om Mexico har en lovpligtig standard, rapporteres der i nogle områder om en bTB-prævalens på over 2 % . I betragtning af tuberkulinprøvens ringe specificitet og følsomhed er den faktiske tilstedeværelse af M. bovis sandsynligvis lavere, og infektionsraten for kvæg med andre mykobakterier er sandsynligvis højere, henholdsvis. Kvægopdrættere, dyrlæger, teknikere og ansatte i husdyrbruget kan således være erhvervsmæssigt udsat for infektioner med M. bovis og NTM. Der er meget lidt viden om erhvervsmæssig eksponering for zoonoser forårsaget af NTM-arter, fordi identifikation af disse arter var en ret vanskelig opgave før udviklingen af identifikationsteknikker baseret på molekylærbiologi.

I øjeblikket er de molekylærbiologiske teknikker, der oftest anvendes til diagnosticering af sygdomme forårsaget af mykobakterier, restriktionsfragmentlængdepolymorfi (RFLP) til diagnosticering af M. tuberkulose , spoligotyping til diagnosticering af M. bovis og påvisning af en 100 basepar (bp) “specifik indsættelse” på 23S rRNA-genet, der er karakteristisk for Gram-positive bakterier med et højt guanin-cytosinindhold (HGC), og som betragtes som en molekylær markør for denne gruppe af bakterier , efterfulgt af sekvensanalyse af 16S rRNA-genet til identifikation af bakterier på artsniveau .

I blandt de NTM-arter, der er identificeret ved hjælp af ovennævnte teknikker, er M. balnei, M. marinum og M. platypoecilus, som har forårsaget overfladiske og dybe hudlæsioner ; M. kansasii fra lungelæsioner ; M. simiae fra generaliserede infektioner ; M. scrofulaceum fra infektioner i huden og de indre organer ; M. szulgai i forbindelse med lungeinfektioner, osteomyelitis, tenosynovitis og lymfadenitis ; M. ulcerans i forbindelse med subkutane granulomer ; M. fortuitum og M. chelonae forbundet med vaskulitis, endokarditis, osteomyelitis, mediastinitis, meningitis, keratitis og hepatitis ; M. abscessus, forbundet med erythematøse læsioner, der udviklede sig til ulcererede knuder ; og andre arter.

Den største procentdel af statens opgørelse for kvæghoveder i staten Mexico i Mexico er koncentreret i den sydlige region, og en af de vigtigste økonomiske aktiviteter er kvægopdræt. Den mexicanske forordning om kvægkontrol NOM-ZOO-031-1995 fokuserer kun på tuberkulinprøven til diagnosticering af M. bovis. Man ved kun lidt om forekomsten af NTM hos kvæg i regionen. I betragtning af muligheden for at identificere arter af actinobakterier ved påvisning af den molekylære 100-baseparsmarkør på 23S rRNA-genet og den efterfølgende sekventering af 16S rRNA-genet er det muligt at identificere de førnævnte NTM-arter.

Målet med denne undersøgelse var at isolere og identificere NTM-arter fra kvæg i den sydlige region i staten Mexico. Mycobacterium-arterne blev isoleret fra prøver af nasale eksudater og kvægmælk og identificeret ved at detektere den molekylære 100-baseparsmarkør i 23S rRNA-genet med efterfølgende sekventering af 16S rRNA-genet.

2. Materialer og metoder

2.1. Prøveudtagning

Der blev foretaget en prøveudtagning baseret på den rumlige fordeling af besætninger, der er positive for kvægtuberkulose i staten Mexico, udført af Zaragoza et al. 2015 . Der blev udvalgt fire kvægbesætninger i den sydlige region af staten Mexico, en besætning tilhørende kommunen Temascaltepec og tre besætninger tilhørende kommunen Zacazonapan. Der blev indsamlet i alt 103 prøver, 35 mælkeprøver og 68 prøver af nasale eksudater. Fordelingen af antallet og typen af indsamlede prøver i hver besætning er vist i tabel 1.

2.2. Udtagning af prøver af mælk og næsesvamp

Udder og brystvorter blev renset med renset vand og sæbe og derefter tørret med papirhåndklæder, og der blev efterfølgende foretaget asepsis af brystvorterne ved hjælp af vatpinde, der var opblødt i 70 % alkohol. Fem milliliter mælk blev opsamlet direkte fra brystvorten i sterile 20 mL-beholdere, idet den første mælkestrøm blev kasseret. Næseekssudat blev opsamlet direkte fra indersiden af næseåbningen ved hjælp af en 10 cm lang steril vatpind, som derefter blev nedsænket i en isotonisk saltvandsopløsning (0,85 %). Prøver af mælk og næseekssudat blev opbevaret ved 4 °C indtil behandling.

2.3. Behandling af prøver

2.3.3.1. Isolering af mykobakterier

Mælkeprøverne blev centrifugeret ved 2500 omdrejninger pr. minut (rpm) i 10 minutter. Pelleterne fra mælke- og næsesekvatprøverne blev inokuleret i følgende kulturmedium, der var selektivt for mykobakterier: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) og Middlebrook (BD BBL 254521) suppleret med 6 g natriumpyruvat pr. liter (Middlebrook-P). De inokulerede medier blev inkuberet ved 37 °C i 8 uger og blev vurderet hver 3. dag.

2.3.2. Klassificering af isolerede stammer

De isolerede stammer blev fordelt i grupper efter følgende karakteristika: koloni-pigmentering, væksttid og koloni-karakteristika (form, konsistens, tekstur og pigmentproduktion). De isolerede stammer blev farvet med Ziehl-Neelsen for at bekræfte tilstedeværelsen af syrefaste baciller (AFB) .

2.4. DNA-ekstraktion

Stammer med mikroskopiske karakteristika, der ligner mykobakterier (syrefaste positivitet), og to repræsentative stammer fra hver gruppe blev udvalgt til identifikation. For at opnå biomasse blev stammerne inokuleret i 30 mL Middlebrook flydende kulturmedium (BD BBL 254521) i 125 mL kolber og inkuberet ved 37 °C i 7 dage. Det flydende medium blev overført til sterile 15 mL Falcon-rør og centrifugeret i 15 minutter ved 14 000 omdrejninger pr. minut. Derefter blev supernatanten fjernet, og pellet blev overført til 1,5 mL Eppendorf-rør; rørene blev derefter centrifugeret ved 14.000 rpm × 5 minutter, og supernatanten blev kasseret. Der blev foretaget DNA-ekstraktion af den resulterende pellet ved hjælp af Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega A1120).

2.5. Påvisning af den molekylære markør i 23S rRNA-genet

Den molekylære markør på 100 bp, der er placeret på 23S rRNA-genet, blev amplificeret i henhold til den metode, der er beskrevet af Roller et al. (1992) ved hjælp af følgende primere: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, og 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

Reaktionen blev udført ved hjælp af en kommerciel Taq DNA-polymerase (Promega M1661). Der blev anvendt følgende termiske cyklusbetingelser: et prædenatureringstrin i 5 minutter (94 °C); 29 cyklusser med denaturering i 30 sekunder (94 °C), hybridisering i 45 sekunder (46 °C) og forlængelse i 50 sekunder (72 °C); og endelig en postelongationscyklus på 5 minutter (72 °C). De amplificerede fragmenter blev bekræftet på en 2 % agarosegel farvet med ethidiumbromid (SIGMA 46065).

2.6. Amplifikation af 16S rRNA-genet

Stammer, der forstærkede den 100 bp fylogenetiske markør, blev udvalgt til 16S rRNA-sekventeringsanalyse. Følgende primere blev anvendt til amplifikationen: 8f: AGAGTTTGATATCMTGGCTCAG og 1492r: TACGGYTACCTTTTGTTACGACTT.

Reaktionen blev gennemført ved hjælp af en kommerciel Taq DNA-polymerase (Promega M1661). Der blev anvendt følgende termiske cyklusbetingelser: et prædenatureringstrin i 5 minutter (94 °C); 34 cyklusser med denaturering i 30 sekunder (94 °C), hybridisering i 20 sekunder (52 °C) og elongation i 1 minut og 30 sekunder (72 °C); og endelig en postelongationscyklus på 7 minutter (72 °C).

De amplificerede fragmenter blev bekræftet på en 1% agarosegel farvet med ethidiumbromid (SIGMA 46065). Produkterne fra denne amplifikation blev renset ved hjælp af Amicon Ultra Filter®-sættet (Millipore UFC901008) og bekræftet på en 1% agarosegel for at verificere deres tilstedeværelse og kvalitet.

2.7. Identifikation af Mycobacterium-arter

De forstærkede produkter af 16S rRNA-genet blev sendt til Macrogen Sequencing Service, Maryland, USA. De opnåede sekvenser blev analyseret og korrigeret ved hjælp af programmet BioEdit . Der blev konstrueret konsensussekvenser ud fra de fremadrettede og omvendte fragmenter, som blev sammenlignet med sekvenser, der tidligere var deponeret i GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) ved hjælp af BLAST-programmet og EzTaxon 2.1 .

2.8. Phylogenetisk analyse

Sekvenser af 16S rRNA-genet blev indhentet for følgende mykobakteriearter fra American Type Culture Collection (ATCC) og den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , og M. confluentis . Sekvenserne af de indsamlede stammer og sekvenserne af de stammer, der blev isoleret i denne undersøgelse, blev afstemt med BioEdit-programmet . Den fylogenetiske analyse blev udført ved hjælp af maximum parsimony-metoden i MEGA-software version 4 . Til at danne roden i kladogrammet blev sekvensen af Pantoea agglomerans DSM 3493 anvendt.

3. Resultater

De 108 stammer isoleret fra de 103 indsamlede prøver blev fordelt i 13 grupper i henhold til deres makroskopiske og mikroskopiske morfologiske karakteristika (tabel 2). Især gruppe 11 og 12 bestod af syrefaste stammer.

Til identifikation på artsniveau blev der udvalgt 39 stammer: 10 af dem tilhørte gruppe 11 og 7 tilhørte gruppe 12. Der blev udvalgt to stammer fra hver af de resterende 11 grupper for at supplere de 39 stammer. Den molekylære 100 bp-markør blev fundet i 33 % (13/39) af de udvalgte stammer. For dem blev 16S rRNA-genet amplificeret med henblik på sekventering og identifikation på artsniveau.

Den samlede prævalens af NTM på de indsamlede prøver var 12,6 % (13/103), idet der blev taget hensyn til både mælk og nasale eksudatprøver. Den specifikke prævalens for nasale exudatprøver var imidlertid 19,1 % (13/68).

I henhold til sekvenssammenligningen blev der identificeret fire NTM-arter af slægten Mycobacterium. 64 % (6/13) af stammerne havde 98 % og 99 % lighed med M. neoaurum, mens 31 % (4/13) havde 99 % lighed med M. parafortuitum, 15 % (2/13) havde ligheder på 98 % og 99 % med M. moriokaense, og endelig havde 8 % (1/13) 99 % lighed med M. confluentis (tabel 3).

Det fylogenetiske træ blev dannet med slægten Mycobacterium og fire af dens arter, hvorved de fylogenetiske relationer mellem indsamlingsstammerne og de stammer, der blev isoleret i den foreliggende undersøgelse, blev observeret (figur 1).

Figur 1

Fylogenetisk træ konstrueret ved sammenligning af 16S rRNA-gensekvenserne fra de isolerede stammer og referencestammerne.

4. Diskussion

NTM-arter blev kun isoleret fra prøver af nasalt eksudat, hvilket udelukkede prøverne fra en af de lokale gårde i denne undersøgelse (tabel 1). Vi fandt, at den specifikke prævalens var 19,1 % i besætninger i den sydlige region i staten Mexico. Lignende undersøgelser i USA, Sydafrika, Tanzania og Brasilien rapporterede om NTM-prævalensværdier på henholdsvis 3,4 %, 24,5 %, 7 % og 7,8 %; derfor ligger den prævalensværdi, der blev fundet i denne undersøgelse, inden for det interval, der tidligere er rapporteret . I denne undersøgelse blev 13 af de 39 analyserede stammer identificeret som NTM-arterne M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis og M. parafortuitum.

M. neoaurum, et medlem af Mycobacterium parafortuitum-komplekset, er ansvarlig for et bredt spektrum af sygdomme, hvoraf de fleste er anordningsrelaterede infektioner såsom Hickman-katetre, BROVIAC-katetre, PICC-ledninger , arteriovenøs fistel, der omfattede et polytetrafluorethylen-transplantat , pace makers , og endokarditis af proteseklapper . Immunsupprimerede patienter med disse anordninger er de vigtigste værter, f.eks. patienter med kræft og diabetikere med nyresvigt og hjerteproblemer . M. neoaurum er også blevet isoleret fra patienter med urinvejsinfektioner , meningoencephalitis og forandringer i centralnervesystemet , bakteriæmi og endokarditis samt lungeinfektioner . Selv om den hovedsagelig er blevet isoleret fra kliniske tilfælde, er der også rapporter om dens isolering fra mælk og kvæg .

M. moriokaense blev isoleret fra en sputumprøve . Selv om den betragtes som ikke-patogen for mennesker, er den blevet forbundet med lungesygdomme . M. confluentis blev også isoleret fra sputumprøver , og sammen med M. parafortuitum betragtes begge arter som ikke-patogene arter . M. confluentis, M. moriokaense og M. neoaurum er blevet isoleret fra forskellige væv fra kvæg og vildtlevende dyr med tuberkuløse læsioner, hvorimod M. parafortuitum kun er blevet isoleret fra kvægmælk . I vores arbejde blev M. parafortuitum imidlertid kun isoleret fra nasale eksudatprøver.

Mykobakteriernes ernæringsbehov varierer mellem de forskellige arter, hvilket var årsagen til, at der blev anvendt forskellige kulturmedier. Især blev syv af de 13 stammer, der blev identificeret i denne undersøgelse, isoleret i Stonebrink-medium, herunder M. neoaurum, M. parafortuitum og M. moriokaense. Dette resultat stemmer overens med det resultat, der er beskrevet af Sepúlveda et al., som angav, at Stonebrink-mediet er velegnet til genvinding af forskellige arter af Mycobacterium-slægten. García-Martos og García-Agudo rapporterede, at Middlebrook-mediet er optimalt til isolering af actinomyceter, hvilket stemmer overens med den foreliggende undersøgelse, idet to arter, M. neoaurum og M. parafortuitum, blev isoleret på dette medium. Især blev M. confluentis kun isoleret i Middlebrook-medium suppleret med natriumpyruvat; strategien med at anvende forskellige kulturmedier var således hensigtsmæssig, fordi den gjorde det muligt at isolere forskellige arter af slægten Mycobacterium.

Detektion af den molekylære markør, der er til stede i 23S rRNA-genet hos Gram-positive bakterier med HGC-indhold, gjorde det muligt at skelne mellem stammer af eubakterier og mycobakterier. Sekventeringsanalysen af 16S rRNA-genet muliggjorde identifikation på artsniveau; derfor er kombinationen af disse metoder velegnet til identifikation af NTM-arter.

5. Konklusioner

Med den metodologi, der er beskrevet i denne undersøgelse, blev fire NTM-arter isoleret og identificeret: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum og M. parafortuitum. Disse arter blev isoleret for første gang fra nasale eksudater fra kvæg fra den sydlige del af staten Mexico. Tre af de identificerede arter (M. neoaurum, M. moriokaense og M. confluentis) er af folkesundhedsmæssig og veterinær betydning.

Oplysning

Dette arbejde er afledt af en afhandling med henblik på en doktorgrad i sundhedsvidenskab (Universidad Autónoma del Estado de México), registreret i PNPC-CONACYT.

Interessekonflikter

Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Anerkendelser

Forfatterne vil gerne anerkende den økonomiske bistand fra Ministeriet for Forskning og Avancerede Studier i Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) gennem følgende forskningsbevillinger: (i) “Implementation of Geographic Information Systems and Techniques of Molecular Biology, as tools in the detection and identification of Mycobacterium spp.”, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, og (ii) netværket “Microbiología y química en las Ciencias de la Salud”, 039/2014RIF.