Immunocytokemiske metoder, teknikker og protokoller

ICC Main Page > Cellefiksering

For at sikre fri adgang for antistoffet til dets antigen, skal cellerne fikseres og permeabiliseres. Generelt er fiksationsstyrker og -tider betydeligt kortere for celler end på de tykkere, strukturelt komplekse vævsafsnit. Ved immuncytokemi består prøveforberedelsen hovedsagelig i at fiksere målcellerne på objektglasset. En perfekt fiksering vil immobilisere antigenerne, samtidig med at den autentiske cellulære og subcellulære arkitektur bevares, og antistofferne får uhindret adgang til alle celler og subcellulære rum. Der anvendes normalt en lang række forskellige fiksationsmidler, og det korrekte valg af metode afhænger af arten af det antigen, der undersøges, og af egenskaberne ved det anvendte antistof. Fixeringsmetoderne kan generelt inddeles i to klasser: organiske opløsningsmidler og tværbindingsreagenser. Organiske opløsningsmidler som f.eks. alkoholer og acetone fjerner lipider og dehydrerer cellerne, mens de udfælder proteinerne på den cellulære arkitektur. Tværbindingsreagenser (f.eks. paraformaldehyd) danner intermolekylære broer, normalt gennem frie aminogrupper, hvorved der skabes et netværk af forbundne antigener. Krydsningsreagenser bevarer cellestrukturen bedre end organiske opløsningsmidler, men kan reducere antigeniciteten af visse cellekomponenter og kræver tilføjelse af et permeabiliseringstrin for at give adgang for antistoffet til prøven. Fixering med begge metoder kan denaturere proteinantigener, og af denne grund kan antistoffer fremstillet mod denaturerede proteiner være mere anvendelige til cellefarvning. Der er beskrevet forskellige fikseringsmetoder. Den passende fikseringsmetode bør vælges i overensstemmelse med den relevante anvendelse.

1. Acetonfiksering

  • Fiksér cellerne i acetone ved -20°C i 5-10 minutter.

  • Ingen permeabiliseringstrin er nødvendigt efter acetonfiksering.

2. Methanolfiksering

  • Fiksér cellerne i methanol ved -20°C i 5-10 minutter.

  • Ingen permeabiliseringstrin er nødvendigt efter methanolfiksering.

3. Ethanolfiksering

  • Fikser celler i afkølet 95 % ethanol, 5 % iseddikesyre i 5-10 minutter.

4. Methanol-acetonfiksering

  • Fikseres i afkølet methanol, 10 minutter ved -20 °C.

  • Fjern overskydende methanol.

  • Permeabiliseres med afkølet acetone i 1 minut ved -20 °C.

5. Methanol-acetone-blandingfiksering

  • 1:1 methanol- og acetone-blanding.

  • Gør blandingen frisk og fikser cellerne ved -20 C i 5-10 minutter.

6. Fixering med methanol-ethanolblanding

  • 1:1 methanol- og ethanolblanding.

  • Blandingen fremstilles frisk, og cellerne fikseres ved -20 C i 5-10 minutter.

7. Formalinfiksering

  • Fiksér cellerne i 10 % neutralt bufferet formalin i 5-10 minutter.

  • Skyl kortvarigt med PBS.

  • Permeabiliseres med 0,5 % Triton X-100 i 10 minutter.

8. Paraformaldehyd-Tritonfiksering

  • Fikseres i 3-4 % paraformaldehyd i 10-20 minutter.

  • Skyl kort efter med PBS.

  • Permeabiliseres med 0,5 % Triton X-100 i 10 minutter.

9. Paraformaldehyd-metanolfiksering

  • Fiksering i 4 % paraformaldehyd i 10-20 minutter.

  • Skyl kort efter med PBS.

  • Permeabiliseres med afkølet methanol i 5-10 minutter ved -20 °C.