Resultater og diskussion

Samlet TE-domænestruktur. Selv om strukturen af det isolerede TE-domæne, der blev løst, repræsenterer to uafhængige molekyler (1 og 2) i den asymmetriske enhed (tabel 1), blev domænet oprenset og fuldt ud aktivt som en monomer (Z.G. og B.C., upublicerede data). Native human FAS er arrangeret som en head-to-tail antiparallel homodimer (1) som visualiseret for nylig i elektron-kryo-mikroskopi (cryo-EM) kort (31). Dette arrangement ville placere de to TE-domæner i FAS-monomererne i modsatte ender af hinanden, hvilket ikke giver nogen funktionel relevans for dannelsen af en dimer. Af disse grunde er dimeren en artefakt fra krystalliseringen. Strukturen af molekyle 1 betragtes i det følgende som en repræsentant for strukturen.

Det humane FAS’s TE-domæne består af to subdomæner (A og B) (fig. 1). Det større subdomæne A (≈23 kDa) består af to ikke sammenhængende segmenter fra amino- (eller N-) og carboxyl- (eller C-) terminale ender (Fig. 1, 2, 3). Det mellemliggende segment er henlagt til den mindre (≈9 kDa) subdomæne B. Subdomæne A har en samlet α/β-foldning, mens subdomæne B har et helt α-helikalt motiv. Hele strukturen består af ni α-helixer og otte β-strenge (fig. 1 og 2). Det meste af hele TE-domænestrukturen kunne indpasses i elektrontætheden, bortset fra de tre segmenter og en glycinrest, der er vist i fig. 1, 2 og 3, med manglende eller svag tæthed, hvilket indikerer deres høje mobilitet. Alle de uordnede segmenter befinder sig i regioner, der er eksponeret for opløsningsmidler, og er ikke i nærheden af at være involveret i krystalkontakter.

De tre katalytiske rester i den menneskelige FAS TE (Ser-2308, His-2481 og Asp-2338) er forbundet med hinanden og de tilstødende rester ved et omfattende hydrogenbindingsnetværk (Fig. 4). Hydroxylgruppen af Ser-2308 er involveret i en kooperativ hydrogenbinding, der accepterer fra den tilstødende amidrygge af Tyr-2309 og donerer til Nε2 af His-2481. Dette ville til gengæld lette aktiveringen af Ser-2308 som nukleofil og bidrage til at stabilisere det oxyanion-tetraedriske mellemprodukt, der forventes at blive dannet under TE-katalytisk reaktion, som det ses i serinhydrolaser. His-2481-resten (Nε2) er til gengæld hydrogenbundet til Asp-2338 (Oδ2). Asp-2338 (Oδ1-atom) laver yderligere hydrogenbindinger med både Ala-2448’s amid i rygsøjlen og Tyr-2462’s hydroxylgruppe. Tyr-2462 er fuldstændig invariant, mens Ala-2448 er delvist bevaret fra insekter til pattedyr (fig. 3). Interaktionen mellem disse rester og den katalytiske aspartatrest synes derfor at være vigtig for at holde Asp-2338 fast i sin særlige position, hvilket yderligere indikerer den vigtige rolle, som denne rest spiller. Det omfattende hydrogenbindingsnetværk på det katalytiske sted holder enzymet klar til at virke ved at orientere og placere de katalytiske rester på de nødvendige positioner, meget lig dem i serinhydrolaser (40).

Palmitoylkædebindingssted og kædelængdespecificitet. For at få en forståelse af den mekanisme, hvormed TE-domænet af FAS regulerer kædelængdespecificiteten, analyserede vi TE-strukturen for tilstedeværelsen af en rille tæt på det katalytiske center, der kunne rumme lange fedtacylkædesubstrater. Der er kun én rille til stede, som er placeret ved grænsefladen mellem subdomænerne A og B (fig. 5). Analyse ved hjælp af proshape (se Materialer og metoder) bekræftede tilstedeværelsen af rillen med et volumen på 186,9 Å3 og et overfladeareal på 140 Å2, hvis distale ende danner en lomme (Fig. 5). Rillen er tæt på TE-domænets aminoterminus, som er forbundet med FAS’ ACP-domæne, der holder de voksende acylkæder til scanning og frigivelse af TE-domænet efter at have nået den optimale længde på 16 kulstoffedtsyrekæden. De fleste af de rester, der beklæder rillen, stammer fra den ampifile helix α8 af underdomæne B. Andre rester, der bidrager til den, stammer fra helix α5 af underdomæne B, den N-terminale helix α1 af underdomæne A og løkken mellem β2 og α2 af underdomæne A. De rester, der beklæder rillen, som for det meste er hydrofobiske af natur, består af Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 og Lys-2426 fra helix α8, Phe-2370 og Phe-2371 fra helix α5, Leu-2222, Leu-2223 og Val-2224 fra helix α1 og Ile-2250 og Glu-2251 fra løkken mellem β2 og α2 (fig. 5A ). Af disse rester er Ile-2250, Glu-2251 og Lys-2426 invariante på tværs af arter, mens Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 og Phe-2423 for det meste er konserverede (Fig. 3). Resten af resterne er fuldstændig bevaret hos pattedyr (Fig. 3). Alle ovenstående observationer tilsammen tyder på, at grænsefladen mellem de to subdomæner er et fremragende fedtsyrekædebindingsområde. Der blev foretaget to eksperimenter for at give troværdighed til forslaget og for at opnå indsigt i fedtacylkædeselektivitet.

Fig. 5.

Lipidbindingssted. (A) Stereobillede af kandidatpalmitoylbindingsrillen for de første 11-12 karboner og lommen for de sidste 5-4 karboner. Hexadecylsulfonylinhibitoren er repræsenteret som en Corey-Pauling-Koltun-rumfyldningsmodel (C, gul; O, rød; S, grøn). Sidekæderne, der beklæder rillen, er vist som kugle-og-pind-figurer (C, gul; O, rød; N, blå). De sidekæder, der udgør det aktive sted, er også vist som kugle- og pindfigurer med samme farveskema som resterne. Kortet over rilleoverfladen er vist som et grønt trådnet. De rester, der udgør rillen, er mærket med undtagelse af Ile-2250, som ikke kan ses, fordi den ligger under inhibitoren. De indledende 11-12 kulstofatomer fra sulfonylgruppen er solventeksponeret med det 11. og 12. kulstofatom ved lommens munding. (B) Et andet billede af rillen og lommen. Pilene angiver rotationerne fra orienteringen i billedet i A til B. Dette billede viser, at det meste af hexadecylinhibitorens fedtacylkæde er eksponeret for opløsningsmidlet.

Først viste vi ved stedbestemt mutagenese, at udskiftninger af flere af de rester, der beklæder rillen og lommen i TE-domænet, reducerede TE-aktiviteten, om end i forskellig grad (tabel 2).

Se denne tabel:

  • Vis inline
  • Vis popup

Tabel 2. Mutationer i kandidatbindingsrillen mindsker aktiviteten af TE

For det andet var vi i stand til at modellere bindingen af en C16 palmitoylkæde-holdig inhibitor hexadecylsulfonyl f luorid (HDSF) ind i rillen. Modelleringen blev styret af dataene fra krystalstrukturen af palmitoylprotein TE 1 (PPT1) med kovalent bundet hexadecylsulfonat (HDS) (PDB ID-kode 1exw; ref. 41) og forstærket ved energiminimering i cns. Ligesom TE indeholder det katalytiske sted for PPT1 en konserveret katalytisk triade af serin, histidin og aspartat. PPT1-HDS-kompleksstrukturen viste dannelsen af den kovalente binding mellem svovlatomet af HDS og oxygenatomet af det katalytiske serin og tilstedeværelsen af fedtacylkæden i en lang, hovedsageligt hydrofobisk overfladegrube af proteinet (41). Det modellerede kovalent bundne HDS i TE-strukturen (vist i fig. 5) afslørede flere træk ved ligandbinding med vigtige funktionelle og biokemiske implikationer. Indpasning af HDS’en forårsagede ingen større omlægning af resterne i bindingsstedet. Palmitoylkæden laver en skarp bøjning i forhold til sulfonatgruppen på en lignende måde som den, der ses i den bundne PPT1-struktur. Palmitoylkæden med 16 kulstofatomer passer godt ind i rillen med de første ≈12 kulstofatomer eksponeret for opløsningsmidlet og de resterende ≈4 kulstofatomer indsat og holdt på plads i den distale lomme. Denne tilpasning er fuldt ud i overensstemmelse med den observation, at FAS TE fra pattedyr katalyserer dannelsen af palmitinsyre som sit hovedprodukt (20). Tilstedeværelsen af de sidste ≈4 kulstofatomer i lommen er med til at binde fedtsyrekæden på plads med henblik på hydrolyse af palmitoylacylsubstratet. Bindingsstedets karakter, som kombinerer en eksponeret rille med en lukket lomme, er unik og designet til denne TE’s specificitet. Konstateringen af, at TE-domænet af pattedyrs FAS’er ikke viser nogen signifikant aktivitet over for fedtacylkædelængder kortere end 14 kulstofatomer (20), kan forklares ved ikke-produktiv binding på grund af den manglende binding og den deraf følgende større mobilitet af de udsatte kortere kæder. De sidste ≈4 kulstofatomer i palmitoylkæden optager delvist den distale lomme, hvilket giver plads nok til kun at rumme yderligere 2 kulstofatomer. Dette resultat er i overensstemmelse med det dramatiske tab af aktivitet, der er set med modelsubstrater, der er længere end 18 kulstofatomer (20). Det er uklart, om de sidste ≈4 og ≈6 kulstofatomer i henholdsvis C16- og C18-fedtacylkæderne vil blive indsat i en præformet lomme mellem de to subdomæner, som det ses i strukturen af den ubundne form, eller om de i første omgang vil blive bundet til en åben form af domænet, der så efterfølgende undergår en hængselsbøjningsbevægelse mellem subdomænerne for at omslutte de terminale kulstofatomer i fedtacylkæderne og skabe den produktive konfiguration af det aktive sted-region.

Der blev gjort en betydelig indsats for at krystallisere TE med forskellige analoger af langkædede fedtsyrer (f.eks, palmitoyl-CoA, myristoyl-CoA, stearoyl-CoA, palmitinsyre, hexadecylsulfonylfluorid og palmitinsyre), men der blev ikke fundet nogen langvarige stabile kompleksstrukturer. De fleste af komplekserne, som vist ved uafhængige enzymaktivitets- eller radioaktive bindingsanalyser i opløsning, dissocierede inden for 5 min til 1 time, hvilket gør dem uegnede til krystallisering eller krystalblødgøringsforsøg.

Cryo-EM Fit af TE-struktur. Selv om den 20-Å cryo-EM rekonstruktionsstruktur af human FAS-dimer er blevet beskrevet (31), var der ingen indikation af den N- til C-terminale polaritet af FAS-underenheden bortset fra en tidligere indikation fra antistofmærkning, at FAS TE-domænet var placeret i en af enderne af hele strukturen (42). Vi forsøgte en foreløbig vurdering af polariteten ved manuelt at docke den mindre (32 kDa) humane FAS TE-domænestruktur fra FAS, som optager den C-terminale ende af FAS-underenheden, og den større (42 kDa) E. coli β-ketoacylsyntase I (eller KSI) krystalstruktur (PDB ID-kode 1ek4) (43), som er en tæt homolog af det N-terminale KS-domæne af pattedyrs FAS, i hver ende af monomerenheden, der betegnes som hoved og fod i cryo-EM-massetætheden (fig. 6). TE-strukturen passer godt ind i spidsen af den understruktur, der er betegnet fod, mens KSI passer bedst ind i spidsen af den understruktur, der er betegnet hoved (fig. 6). I FAS-dimeren interagerer ACP-domænet med både TE-domænet i den samme monomer og ketoacylsyntase-domænet i den modsatte monomer, hvilket fører til dannelse af to aktive centre i dimerens to ender. Orienteringen af TE-domænet og KS-domænets homologe for den bedste tilpasning ved henholdsvis foden og hovedet imødekom både plads og funktionel interaktion af ACP-molekylet med begge proteiner. Når strukturerne blev byttet om, var tilpasningen meget dårligere, idet nogle dele af KSI faldt uden for tætheden og et større volumen af uberegnet tæthed i TE-tilpasningen (fig. 6).

Fig. 6.

Foreløbig tilpasning af TE (grønt rygsøjlespor) og KSI (maroonfarvet spor) i 20-Å opløsning cryo-EM massetæthed. De understrukturer, der ses af massefylden, betegnes Hoved, Torso og Fod. TE-sporet passer bedst i den understruktur, der er betegnet Foot, mens KSI-ryggen passer bedst i den understruktur, der er betegnet Head. Den bedste tilpasning for både KSI og TE er indcirklet med rødt. De grundlæggende spor for TE og KSI i bunden af massetætheden passer mindre godt til henholdsvis hoved og fod. På grundlag af tidligere proteolytiske fordøjelsesforsøg med intakt FAS blev der identificeret tre domæner: domæne I, som omfatter KS-AT/MT-DH-enzymcentrene og linkerregionen; domæne II, som omfatter ER-KR-ACP-regionen; og domæne III, som er tildelt TE (1, 2). Hoved- og torso-understrukturerne, som i det væsentlige er sammenvokset, kunne svare til domæne I og dele af domæne II, og foden kunne repræsentere resten af domæne II og domæne III.

Konklusioner. De vigtigste konklusioner, der kan drages af krystalstrukturen af TE-domænet af humant FAS, er som følger. (i) TE-domænet består af to subdomæner, der adskiller sig i størrelse og foldningsmotiver. (ii) Det større A-subdomæne udviser et α/β-motiv, mens det mindre B-subdomæne er helt spiralformet. (iii) Subdomæne A bidrager med den katalytiske triade af Ser-, Asp- og His-rester. (iv) Den lange rille med en distal lomme mellem subdomæne B og dele af subdomæne A udgør fedtacylkædens bindingssted. Geometrien og arten af dette sted er i overensstemmelse med TE’s høje specificitet over for C16 til C18 fedtacylsubstrater. Rillen fungerer som en lineal, der måler den korrekte substratlængde. (v) Den foreløbige tilpasning af TE’en til den intakte humane FAS-kryo-EM-struktur tyder på en plausibel N- til C-terminuspolaritet af underenhederne. Der er imidlertid behov for et cryo-EM-kort med højere opløsning for yderligere verifikation af tilpasningen og en dybtgående analyse af FAS-funktionen.