En sammenligning af immunohistokemi og Western Blot

Af Sarah Moore, M.Sc.Reviewed by Michael Greenwood, M.Sc.

Immunohistokemi og Western Blotting fungerer begge ved at udnytte princippet om, hvordan antistoffer specifikt binder til de antigener, der findes i biologisk væv.

Image Credit: Sinitar/.com

Immunohistokemi er den mest almindelige af immunfarvningsmetoderne. Den visualiserer tilstedeværelsen af målrettede antigener i en vævsprøve ved hjælp af antistoffer, der knytter sig til antigenerne, har en katalytisk virkning og opsplitter molekylet i identificerbare forbindelser. Visualisering af denne interaktion kan opnås ved at anvende et enzym (der producerer et kromogent signal) eller en fluorofor (der skaber et fluorescerende signal)

Western blot fungerer efter samme princip. Det blev første gang beskrevet tilbage i 1970’erne, da forskerne først brugte det til at klassificere forskellige proteiner, der findes i biologisk væv, med succes. Siden da er der sket betydelige fremskridt i teknologien, hvilket har ført til etableringen af den moderne fluorescerende, kolorimetriske og kemiluminescerende Western Blot-teknik.

Alle versioner af Western Blot-metoden er baseret på antigen-antistofkompleksets funktion for at identificere specifikke proteiner, der er til stede i en prøve, hvilket indikeres af enten enzym-substratreaktioner af kolorimetriske, kemiluminescerende eller fluorescerende molekyler. Det lys, der produceres af disse kilder, kan bruges til at udlede tilstedeværelsen og koncentrationen af proteinerne i en prøve.

Sammenligning af teknikkerne

Selv om de to metoder er baseret på princippet om antistof-antigen-interaktion, er der nogle væsentlige forskelle mellem de to teknikker. Nedenfor opdeler vi dem, trin for trin.

For det første skal prøven for begge teknikker forberedes korrekt for begge teknikker. Forberedelsen adskiller sig ganske betydeligt mellem de to. Til immunohistokemi skæres vævsprøverne i skiver eller efterlades hele, afhængigt af deres størrelse.

Grænsen for prøvernes størrelse ligger generelt mellem 3 µm og 5 µm. Derefter indlejres prøverne i et medium, normalt paraffinvoks eller cryomedia. Herefter anbringes skiverne på objektglas og dehydreres ved hjælp af alkoholvaske med stigende styrke og slutter til sidst med, at der tilsættes et detergent for at rense prøven, så den er klar til at blive set i et mikroskop.

På den anden side kræver Western Blot, at prøverne først adskilles ved elektroforese og derefter immobiliseres i en blottingmembran.

Metoden til farvning af prøverne er også lidt forskellig mellem de to teknikker. Immunohistokemi tilføjer enten polyklonale eller monoklonale antistoffer. Disse antistoffer klassificeres som enten primære eller sekundære reagenser, idet de første er opdrættet mod et målantigen og normalt er ukonjugerede, mens de sidstnævnte er konjugeret til et linkermolekyle, som derefter rekrutterer reportermolekyler.

Den konjugerede version anvendes i en direkte farvningsmetode, hvor antistoffet reagerer direkte med antigenet i prøven, mens den ukonjugerede version anvendes i en indirekte farvningsmetode, hvor det ukonjugerede antistof binder sig til målantigenet i vævet, hvilket får et sekundært antistof til at reagere med det primære antistof.

I Western Blot-metoden til sammenligning tilsættes et fluorescerende farvestof til prøven, hvorefter den eksponeres for en lyskilde med en passende bølgelængde for at excitere fluorhorernes molekyler.

Efter et stykke tid afgiver de exciterede fluorophorer til sidst den energi, de har fået fra lyskilden, og vender tilbage til deres grundtilstand. Denne frigivelse af energi er det, der får fluorhorerne til at fluorescere og udsender en lyskilde, der kan opfanges af et digitalt billeddanner.

Sammenligning af fordele og ulemper

Den største fordel ved immunohistokemi er, at metoden giver forskerne mulighed for at påvise den nøjagtige placering af et målprotein i en vævsprøve. Denne hovedfordel har ført til, at den er blevet veletableret inden for neurovidenskab som en robust metode til undersøgelse af proteinekspression på målhjernens steder.

Men på den anden side har metoden en stor ulempe i forhold til Western Blot-metoden. Dette er det faktum, at farvningerne ikke kontrolleres i forhold til en molekylvægtsstige, som de gør i Western blot, hvilket betyder, at der ikke er nogen måde at bevise, at den farvning, der vises i immunohistokemi, er endeligt relateret til et specifikt protein.

Den indirekte metode til immunohistokemi er anerkendt for at være meget følsom, men den direkte metode er kendt for at være det modsatte og er generelt ude af stand til at påvise små koncentrationer af målantigener.

Western blot-metoden er fordelagtig, idet den har etableret sig som en pålidelig teknik til indsamling af kvantitative data. Dens mest fremtrædende fordel er dog, at den har vist sig at være effektiv til at generere et signal, der er proportionalt med mængden af det protein, der findes i prøven.

Også Western Blot-metoden vælges ofte på grund af dens evne til at detektere mange målproteiner samtidig, hvilket har den effekt, at testtiden reduceres betydeligt, samt at antallet af nødvendige ressourcer reduceres.

En forskel i anvendelser

Der er et stort overlap i anvendelsen af de to teknikker, da de er så ensartede. Overordnet set er immunohistokemi dog mest afhængig af som et diagnostisk værktøj til mange kræftformer.

Metoden bruges til at identificere unormale celler, der er karakteristiske for visse tumorer. Metoden anvendes også i vid udstrækning til at identificere og lokalisere proteiner og biomarkører, der findes i både normalt og sygt væv. Endelig bruges den også ofte til at påvise talrige infektiøse organismer i væv.

I sammenligning hermed bruges Western Blot mest til påvisning af autoimmune sygdomme, allergier og infektionssygdomme. Den anvendes i vid udstrækning inden for molekylærbiologi, biokemi og cellebiologi, og dens mest bemærkelsesværdige anvendelser anvendes som et diagnostisk værktøj til HIV og BSE.

Videre læsning

• Alt indhold om immunhistokemi
• Immunohistokemi (IHC) Billeddannelsesteknikker
• Enzymatisk immunhistokemi (IHC)
• Multifarvet immunhistokemi (IHC)
• Hvordan virker immunhistokemi?

Skrevet af

Sarah Moore

Efter at have studeret psykologi og derefter neurovidenskab fandt Sarah hurtigt sin glæde ved at forske og skrive forskningsartikler; det blev til en passion for at forbinde idéer med mennesker gennem skriftlighed.

Sidste opdatering 3. februar 2020

Citationer

Benyt venligst et af følgende formater til at citere denne artikel i dit essay, papir eller rapport:

• APA

  Moore, Sarah. (2020, februar 03). En sammenligning af immunohistokemi og Western Blot. News-Medical. Hentet den 26. marts 2021 fra https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx.

• MLA

  Moore, Sarah. “En sammenligning af immunohistokemi og Western Blot”. News-Medical. 26. marts 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx>.

• Chicago

  Moore, Sarah. “En sammenligning af immunohistokemi og Western Blot”. News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx. (besøgt 26. marts 2021).

• Harvard

  Moore, Sarah. 2020. En sammenligning af immunohistokemi og Western Blot. News-Medical, set 26. marts 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/A-Comparison-of-Immunohistochemistry-and-Western-Blot.aspx.