Doxycyclin er antiinflammatorisk og hæmmer stafylokokker eksotoksininducerede cytokiner og kemokinerInducerede cytokiner og kemokiner

Stafylokokker toksisk chok-syndrom-toksin 1 (TSST-1) og de strukturelt beslægtede exotoksiner er bakterielle exotoksiner, der binder direkte til større histokompatibilitetskompleks-klasse II-molekyler på antigenpræsenterende celler (1, 5, 8, 18, 23) og aktiverer T-celler, der udtrykker specifikke Vβ-elementer (7). Disse toksiner kaldes superantigener på grund af deres evne til polyklonalt at stimulere store populationer af T-celler (1, 4, 7, 14). Stafylokokkerekotoksiner (SE) er således potente aktivatorer af immunsystemet og forårsager en række sygdomme hos mennesker, herunder fødevareforgiftning, toksisk chok og autoimmune sygdomme (1, 2, 6, 12, 14, 22). Deres interaktioner med celler i immunsystemet resulterer i en massiv produktion af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner (1, 4, 15, 17). Cytokinerne tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), interleukin-1 (IL-1) og gammainterferon (IFN-γ) er nøglemediatorer i superantigeninduceret toksisk chok (1, 21). Både TNF-α og IL-1 har potente immunstimulerende aktiviteter og virker synergistisk med IFN-γ for at forstærke immunreaktioner og fremme vævsskader (16). Disse cytokiner er derfor patogene ved høje koncentrationer in vivo og er ansvarlige for feber og toksisk shock induceret af SE (13, 14, 18, 19).

Doxycyclin er et bredspektret antibiotikum, der anvendes i vid udstrækning til infektioner forårsaget af både gramnegative og grampositive mikroorganismer. Det virker som et bakteriostatisk middel og er meget effektivt mod mange mikroorganismer, herunder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis og Yersinia pestis. Doxycyclin tilhører tetracyclin-antibiotikafamilien, hvis medlemmer har vist sig at have andre biologiske virkninger uafhængigt af deres antimikrobielle virkninger (10). Doxycyclin hæmmer phorbol-12-myristat-13-acetat-medieret matrixmetalloproteinase 8 (MMP-8) og MMP-9 i humane endotelceller (11). Doxycyclin mindsker også nedbrydningen af elastin og reducerer MMP-aktiviteten i en model af aneurisme (3). For nylig blev det vist, at doxycyclin hæmmer produktionen af IL-1β i lipopolysaccharidbehandlede hornhindeepitelkulturer i et omfang, der kan sammenlignes med det, der opnås ved hjælp af kortikosteroider (25). In vivo beskyttede doxycyclin mus mod dødelig endotoxæmi ved at nedregulere cytokin- og nitratudskillelsen i blodet (20). Denne undersøgelse blev foretaget for at bestemme den modulerende virkning af doxycyclin på stafylokokker-superantigen-induceret T-celleaktivering og cytokinproduktion fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC).

Humane PBMC blev isoleret ved Ficoll-Hypaque tæthedsgradientcentrifugering af hepariniseret blod fra normale humane donorer. PBMC (106/ml) blev dyrket ved 37 °C i 24-hulsplader indeholdende RPMI 1640-medium og 10 % varmeinaktiveret føtal bovin serum. Cellerne blev inkuberet med enten SEB (200 ng/ml) eller TSST-1 (200 ng/ml) i 16 timer, og supernatanterne blev høstet og analyseret for IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α og MIP-1β. Cytokiner og kemokiner blev målt ved en enzyme-linked immunosorbent assay med cytokin- eller kemokin-specifikke antistoffer i overensstemmelse med producentens instruktioner (15, 17). Humane rekombinante cytokiner og kemokiner (20 til 1.000 pg/ml) blev anvendt som standarder til kalibrering på hver plade. Detektionsgrænsen for hver analyse var 20 pg/ml. Cytokin- og kemokindataene blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) for duplikatprøver. Doxycyclin, hvis det var til stede, blev tilsat samtidig med det stimulerende middel. Cytotoksicitet blev målt ved frigivelse af laktatdehydrogenase (LDH) fra cytosol til kultursupernatant. LDH blev kvantificeret ved hjælp af et kolorimetrisk cytotoksicitetsassaykit (Boehringer Mannheim) efter producentens anvisninger. Den maksimale mængde LDH, der kunne frigives (100 %), blev opnået ved at lysere cellerne med 1 % Triton X-100. T-celleproliferation blev analyseret med PBMC (105 pr. brønd), som blev udplottet i tre eksemplarer med SEB eller TSST-1 (200 ng/ml), med eller uden doxycyclin, i 48 timer ved 37 °C i mikrotiterplader med 96 brønde. Cellerne blev pulseret med 1 μCi thymidin (New England Nuclear, Boston, Mass.) pr. brønd i løbet af de sidste 5 h af kulturen som tidligere beskrevet (15). Cellerne blev høstet på glasfiberfiltre, og inkorporeret thymidin blev målt ved flydende scintillation. Alle data blev analyseret for signifikante forskelle ved hjælp af Student’s t-test med Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Forskelle mellem doxycyclin-behandlede og ubehandlede kontrolgrupper blev betragtet som signifikante, hvis P var <0,05.

På baggrund af rapporten om, at doxycyclin blokerede lipopolysaccharid-induceret IL-1 i epitelceller og forhindrede dødelig endotoxæmi in vivo (20, 25), testede vi hypotesen om, at dette antibiotikum kunne have direkte virkninger på SE-inducerede cytokiner. Som vist i fig. 1 hæmmede doxycyclin dosisafhængigt produktionen af cytokinerne IL-1β, IL-6, TNF-α og IFN-γ og kemokinerne MCP-1, MIP-1α og MIP-1β af PBMC inkuberet med SEB. En lignende dosisafhængig reduktion af cytokiner og kemokiner ved doxycyclin blev også observeret for TSST-1-stimulerede PBMC (data ikke vist). Den hæmmende virkning af doxycyclin på SEB- eller TSST-1-medierede cytokiner og kemokiner opnået med PBMC fra syv normale donorer er opsummeret i fig. 2. Produktionen af MCP-1 og IFN-γ blev fuldstændig blokeret af 50 μM doxycyclin. Denne koncentration af doxycyclin reducerede IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α og MIP-1β til henholdsvis 15 til 22 %, 37 til 41 %, 21 til 25 %, 10 til 15 % og 59 til 61 % af den for ubehandlede, SEB- eller TSST-stimulerede celler. TNF-β, når det var til stede, blev også hæmmet til 25 % af niveauet for ubehandlede, SEB-stimulerede celler. Doxycyclin var ikke cytotoksisk for PBMC ved denne koncentration som målt ved udelukkelse af trypanblåt og manglende frigivelse af laktatdehydrogenase fra behandlede celler. Der blev observeret fuldstændig hæmning af disse cytokiner og kemokiner ved høje doser af doxycyclin (>0,1 mM). Tilsvarende dosis-respons-hæmning af doxycyclin blev observeret ved lavere koncentrationer af SEB (1 og 10 ng/ml) (data ikke vist).

Da superantigener også forårsager T-celleproliferation, blev virkningen af doxycyclin på SE-induceret T-celleproliferation undersøgt. Figur 3 viser, at doxycyclin hæmmer SEB- og TSST-1-stimuleret T-celleproliferation på en dosisafhængig måde, idet der opnås 98 % hæmning ved 0,05 mM.

Denne undersøgelse viste, at doxycyclin effektivt hæmmer superantigenmedieret produktion af cytokiner og kemokiner af humane PBMC in vitro. T-celleproliferation induceret af stafylokok-superantigener blev også undertrykt fuldstændigt. Nedregulering af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner ved hjælp af doxycyclin i SEB- og TSST-1-stimulerede PBMC tyder på, at doxycyclin kan påvirke patofysiologien ved toksisk chok. Disse resultater udvider andre forskeres observationer af de immunmodulerende virkninger af doxycyclin ud over dets antimikrobielle aktiviteter.

Flere molekylære mekanismer, både transkriptionelle og posttranskriptionelle, kan være involveret i de antiinflammatoriske virkninger af doxycyclin (11, 26). Undertrykkelsen af proinflammatoriske cytokiner kan involvere nedregulering af PKC-vejen ved doxycyclin, som det fremgår af en undersøgelse af dets virkninger på granulomdannelse (26). Den rapporterede inhiberende dosis af doxycyclin (10 til 15 μM), der reducerer kollagenase, gelatinase og andre metalloproteinaser in vitro (10, 11), er sammenlignelig med den dosis, der er anvendt i denne undersøgelse, og er flere gange højere end den dosis, der er observeret i humant serum efter oral dosering af 200 mg dagligt (10, 24). Kliniske undersøgelser viser imidlertid, at denne dosis var tilstrækkelig til at reducere kollagenase- og gelatinaseaktiviteterne i humane osteoartritiske bruskekstrakter ex vivo (24). En subantimikrobiel dosis af doxycyclin (20 mg to gange dagligt) har vist sig at hæmme gingivalvæskens kollagenaseaktivitet (9). Desuden viste in vivo-undersøgelser af eksperimentel endotoxæmi også, at doxycyclin og andre tetracykliner var effektive til at nedregulere inflammatoriske cytokiner og forebygge chok (20).

Sammenfattende viser de her præsenterede resultater, at doxycyclin nedregulerer proinflammatoriske cytokiner og kemokiner, hvilket tyder på dets potentielle anvendelighed til behandling af superantigeninduceret toksisk chok. I en klinisk situation, hvor værten er udsat for flere biologiske agenser, herunder både bakterier og bakterielle exotoxiner, giver brugen af doxycyclin den yderligere fordel, at det giver både antimikrobielle og antiinflammatoriske virkninger.