ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTIKEL

DIAGNOSISERING AF ALPHA-1-ANTITRYPSINMANGEL VED DNA-ANALYSE AF BØRN MED LEVERSYGDOM*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 og Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Baggrund – Alfa-1-antitrypsinmangel er en genetisk lidelse, som overføres i en co-dominant, autosomal form. Alpha-1-antitrypsinmangel påvirker hovedsagelig lungerne og leveren, hvilket i sidstnævnte tilfælde fører til neonatal kolestase, kronisk hepatitis eller cirrose. En præcis diagnose af alfa-1-antitrypsinmangel kan stilles ved biokemisk eller molekylær analyse. Formål – Formålet med denne undersøgelse var at anvende DNA-analyse til at undersøge tilstedeværelsen af alfa-1-antitrypsinmangel hos 12 børn, som mistænkes for at have denne mangel, og som viste laboratorie- og kliniske karakteristika for sygdommen. Patienter og metoder – Tolv patienter i alderen 3 måneder til 19 år, som havde serum alfa-1-antitrypsinniveauer lavere end normalt og/eller havde leversygdom af udefineret ætiologi, blev undersøgt. De muterede alleler S og Z i alfa-1-antitrypsin-genet blev undersøgt hos de 12 børn. Alpha-1-antitrypsin-genets organisering blev analyseret ved amplifikation af genoma ved hjælp af polymerasekædereaktion og fordøjelse med restriktionsenzymerne Xmnl (S-allel) og Taq 1 (Z-allel). Resultater – Syv af de 12 patienter havde kronisk leversygdom af udefineret ætiologi, og de øvrige fem patienter havde lave serumniveauer af alfa-1-antitrypsin samt en diagnose af neonatal kolestase og/eller kronisk leversygdom af udefineret ætiologi. Fem af de 12 patienter var homozygote for Z-allelen (ZZ) og to havde S-allelen med en anden allel (*S) forskellig fra Z. Konklusion – Disse resultater viser, at alfa-1-antitrypsinmangel er relativt hyppig hos børn med kronisk leversygdom af udefineret ætiologi og/eller lave alfa-1-antitrypsinniveauer (41,6 %). En korrekt diagnose er vigtig for en effektiv klinisk opfølgning og for genetisk rådgivning.

HEDER ¾ Alfa-1-antitrypsinmangel. Molekylær diagnose. Leverbiopsi.

INDLEDNING

Alpha-1-antitrypsin (A1AT) er et 52 kDa-glykoprotein, der hovedsageligt produceres af hepatocytter, som frigiver 2 g af dette protein pr. dag i blodstrømmen(36). A1AT’s hovedfunktion er at hæmme virkningen af neutrofilt elastase, en serinprotease, der hydrolyserer elastinfibre i lungerne(38). Mutationer i det gen, der koder for A1AT, producerer et protein uden hæmmende evne og kan føre til ophobning af A1AT i inklusionskorpuskel i hepatocytter, hvorved de normale serumniveauer af dette protein reduceres(4). Denne mangel viser sig som lungeemfysem, kronisk bronkitis eller bronkiektase(9). Ophobning af mutant A1AT i hepatocytter kan også føre til neonatal kolestase, kronisk hepatopati eller cirrose(33, 34).

A1AT-genet er meget polymorft, co-dominant og er placeret på den længere arm af kromosom 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Der er beskrevet 75¾ fem alleler (betegnet A-Z i henhold til deres isoelektriske punkter) for dette gen baseret på isoelektrisk fokusering af serum mellem pH 4 (anode) og pH 5 (katode) i polyacrylamidgeler. De almindelige varianter migrerer til midten af gelen og hører derfor til M-familien (“middle”). En mangelfuld variant, der oprindeligt blev beskrevet af LAURELL og ERIKSSON i 1963(21), migrerer mod katoden og betegnes Z. En anden variant, der bevæger sig langsomt i gelen, betegnes S(5). Dette polymorfe “locus” er generelt kendt som Pi-systemet (proteaseinhibitor). De fleste af varianterne producerer A1AT af normal mængde og kvalitet(7, 8, 25). Nogle alleler, såsom varianterne S og Z, er imidlertid forbundet med en mangelfuld tilstand, der opnår polymorfe frekvenser som kaukasiske befolkninger, og der er rapporteret om tilfælde af en nulallel, hvor proteinproduktionen er helt fraværende(10).

S allelen skyldes substitution af adenin med thiamin i genets exon III, hvilket fører til, at glutaminsyre i position 264 udskiftes med valin og den deraf følgende dannelse af en ustabil proteinstruktur(10, 11, 19). Z-allelen skyldes substitution af guanin i position 342 med adenin i genets exon V og fører til dannelse af et protein, der samler sig på den indre ru overflade af hepatocyttens endoplasmatiske reticulum(6). Diagnosen af en mangelfuld tilstand stilles normalt efter kvantificering af serumniveauet af proteinet sammen med den elektroforiske profil efter isoelektrisk fokusering(23, 37). En mere præcis diagnose kræver genanalyse ved hjælp af DNA-baserede teknikker(12, 14, 26).

Sigtet med denne undersøgelse var at identificere S- og Z-allelbærere hos patienter, der mistænkes for at have denne mangel, og som viste laboratorie- og kliniske karakteristika for denne sygdom.

PATIENTER OG METODER

Patienter

I perioden fra februar 1988 til august 1997 blev et stort antal patienter henvist til den pædiatriske gastroenterologiske afdeling, State University of Campinas, Campinas, SP, Brasilien, med henblik på undersøgelse af leversygdomme. Af dette antal var det kun 12 patienter, der ikke viste nogen sikker diagnose (negative resultater for viral hepatitis, autoimmun hepatitis og Wilsons sygdom). Disse patienter blev underkastet en molekylær analyse af A1AT.

Metoder

1 ¾ Undersøgelsesprotokol

2 – Leverbiopsi

Percutane leverbiopsier blev fremstillet som beskrevet af MOWAT(24) under lokalbedøvelse hos patienter, der var fastet i mindst 4 timer, havde venoklyse og normal protrombinaktivitet. Det opnåede fragment blev straks anbragt i 10 % formalin og derefter behandlet og farvet med hæmatoxylin-eosin, Massons trikrom, preussisk blå og sølvimprægnering af retikulumfibrene. Der blev opnået en særlig farvning ved hjælp af PAS (periodic acid-Schiff) efterfulgt af behandling med diastase. Vedvarende eosinofillignende cytoplasmiske granula, selv efter anvendelse af diastase, blev anset for at være positive for A1AT-mangel.

3 – Molekylær analyse

For at undersøge de mutante alleler S og Z i A1AT blev der foretaget en DNA-ekstraktion af perifere blodleukocytter som anvendt i den metode, der er beskrevet af WOODHEAD et al.(39).

RESULTATER

Fem af de 12 undersøgte børn var Z-homozygoter (ZZ), mens to af børnene havde S-allelen sammen med en anden allel, som ikke var Z (*S). Tabel 1 viser patientens alder på tidspunktet for blodprøvetagningen og den indikation, der blev anvendt til at træffe beslutning om den efterfølgende analyse. Tre af patienterne havde neonatal kolestase som en første manifestation af kronisk hepatopati.

Tabel 2 viser serumniveauerne af ALT, AP, gGT, A1AT samt resultaterne af den molekylære undersøgelse og leverbiopsien.

De fem patienter med ZZ-genotypen havde nedsatte A1AT-niveauer i serum, og leverbiopsien viste cirrose (en), neonatal hepatitis (to), mangel på interlobulære galdegange (en) og kronisk hepatitis (en). I dette sidste tilfælde (FSP) sås eosinofillignende cytoplasmiske granula i periportale hepatocytter efter farvning med HE og efterfølgende bekræftet af PAS-positivitet og diastaseresistens (figur 1). De to patienter med neonatal kolestase (EKBA og RHBP) gennemgik en leverbiopsi, da de var henholdsvis 10 uger og 13 uger gamle, og viste eosinofile PAS-positive, diastase-resistente globuler.

Figur 2 og 3 viser resultaterne af amplifikationen og fordøjelsen af henholdsvis S- og Z-allelerne.

DISKUSSION

Alpha-1-antitrypsinmangel er en af de mest almindelige genetiske lidelser, der fører til leversygdom hos børn, og det er den mest almindelige genetiske sygdom, der kræver levertransplantation(17, 28). A1AT-mangel rammer 1 ud af 1600-2000 nyfødte i Nordamerika og Nordeuropa(28, 31), men kun 10-15% af befolkningen med denne mangel udvikler leversygdomme(32, 33). Ifølge en undersøgelse offentliggjort af SVEGER i 1988(33) udvikler 11% af patienterne med PIZZ-fænototypen i løbet af den neonatale periode icterisk hepatitis i løbet af den neonatale periode. I denne undersøgelse havde tre patienter, der var diagnosticeret med en A1AT-mangel, neonatal kolestase, og hos to af disse blev kolestasen betragtet som idiopatisk, før der blev stillet en sikker diagnose af manglen, før der blev stillet en endelig diagnose af manglen. Fem til 10 procent af de tilfælde af idiopatisk neonatal hepatitis, der er rapporteret i litteraturen, er forårsaget af en A1AT-mangel(3).

I fem undersøgte patienter med denne mangel var serumniveauet af A1AT under den normale nedre grænse. Denne test bekræftede dog ikke absolut diagnosen af sygdommen. Da A1AT er et protein fra den akutte inflammatoriske fase, øges dets syntese under inflammatoriske/infektiøse tilstande, neoplasi, graviditet og under behandling med østrogener og kortikosteroider(16, 22). En reduktion i serumniveauet af A1AT forekommer ved respiratorisk angstsyndrom hos nyfødte, i den terminale fase af leversvigt, ved cystisk fibrose og i situationer, hvor der er et stort proteintab(15). Serumniveauerne i SZ-genotyper, som teoretisk set kunne resultere i leversygdomme, er normalt normale.

Når neonatal kolestase er til stede, er det grundlæggende nødvendigt med en differentialdiagnose med ekstrahepatisk biliær atresi. Den kliniske historie gør det muligt at stille en passende diagnose i 83 % af tilfældene(1) , og det er nødvendigt med specifikke undersøgelser for at forbedre diagnosens nøjagtighed. Blandt disse undersøgelser er leverbiopsien af stor betydning. De histopatologiske ændringer, der ses i leverbiopsien hos patienter med A1AT-mangel, kan være de samme som dem, der observeres ved idiopatisk neonatal hepatitis eller i tilfælde af ekstrahepatisk biliær atresi(24). Tilstedeværelsen af overvejende periportale, intrahepatocystiske kugler, der er stærkt PAS-positive efter diastasefordøjelsen, er en nyttig indikation på A1AT-mangel(13, 18, 27). Det er dog vanskeligt at identificere disse globula før den 12. uge efter fødslen(35). I denne undersøgelse havde patient EKBA globuler med ovennævnte karakteristika i levervæv i en alder af 10 uger. Der blev ikke set sådanne kugler hos patient JCI (13 uger gammel). Disse resultater tyder på, at tilstedeværelsen af globules bør undersøges ved hjælp af specielle farvninger i leverfragmenter, der er udtaget før 12 ugers alderen, selv om et negativt resultat ikke udelukker muligheden for A1AT-mangel. Biokemisk analyse blev ikke anvendt i denne undersøgelse, da DNA-analyse, som er mere præcis, var mulig.

An A1AT-mangel er relativt hyppig hos børn, der har leversygdom af udefineret ætiologi. Denne diagnose er undervurderet, sandsynligvis fordi der anvendes upræcise diagnostiske metoder. Molekylær analyse giver en mere præcis diagnose og kan også være nyttig i forbindelse med genetisk rådgivning af patienter med hepatisk sygdom af ukendt ætiologi.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. As manifestações clínicas principais incluem acometimento pulmonar e hepático. Este último, apresenta-se como colestase neonatal, hepatite crônica ou cirrose. Den endelige diagnose stilles ved biokemisk analyse af alfa-1-antitrypsin eller molekylær analyse. Formål – At undersøge, i en gruppe på 12 børn med mistanke om mangel på alfa-1-antitripsina, en tilstedeværelse af mangel ved hjælp af DNA-analyse for at kunne foretage en endelig diagnose, samt en sammenhæng mellem mangel på alfa-1-antitripsina og de kliniske og laboratoriemæssige karakteristika, der er konstateret. Kasuistik og metoder – Mutante alleler S og Z i alfa-1-antitrypsin-genet blev undersøgt hos 12 patienter i alderen fra 3 måneder til 19 år, henvist af det pædiatriske gastroenterologiske ambulatorium på Universidade Estadual de Campinas, SP, Brasilien, med et serum-alfa-1-antitrypsin-niveau lavere end normalt og/eller leversygdom uden defineret ætiologi. DNA-analysen blev udført ved hjælp af den modificerede polymerasekædereaktionsgenamplifikationsmetode, der skaber restriktionssteder for enzymerne Xmnl (S-allel) og Taq l (Z-allel). Resultater – Af de 12 patienter, der blev henvist, havde 7 kronisk leversygdom uden defineret ætiologi, og de øvrige 5 havde lave serum alfa-1-antitrypsindoser ledsaget af en diagnose af neonatal kolestase og/eller kronisk leversygdom af ukendt ætiologi. I denne gruppe på 12 patienter blev der observeret fem homozygote Z-patienter (ZZ), og to patienter bar S-allelen sammen med en anden allel, som var forskellig fra Z (*S). Konklusion – Disse resultater viser, at A1AT-mangel er en relativt hyppig ætiologi hos børn med kronisk leversygdom uden defineret ætiologi og/eller lav serum A1AT-dosis (41,6 %). Betydningen af en sikker diagnose af manglen er berettiget ikke kun for den kliniske opfølgning af patienten, men også med hensyn til genetisk rådgivning.

DESCRITorer ¾ Alpha-1-antitrypsinmangel. Molekylær diagnose. Leverbiopsi.

1. Alagille D. Cholestase i de første tre måneder af livet. Prog Liver Dis 1979;6;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. To nye ikke-radioaktive polymerasekædereaktionsbaserede assays af tørrede blodpletter, genomisk DNA eller hele celler til hurtig og pålidelig påvisning af Z- og S-mutationer i Alpha-1-antitrypsin-genet. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Molekylært grundlag for alfa-1-antitrypsin-mangel. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. Acumulation af PiZ alfa-1-antitrypsin forårsager leverskader hos transgene mus. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. DNA-restriktionsfragmenter forbundet med alfa 1-antitrypsin indikerer en enkelt oprindelse for mangelsallelen PI Z. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Alpha 1-antitrypsin-genet og dets mutationer. Kliniske konsekvenser og strategier for behandling. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Alpha-1-antitrypsinmangel forårsaget af alfa-1-antitrypsin Nullmattawa-genet. En indsættelsesmutation, der gør alfa-1-antitrypsin-genet ude af stand til at producere alfa-1-antitrypsin. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Hurtig DNA-analyse af alfa-1-antitrypsinmangel: anvendelse af en forbedret metode til amplifikation af muteret gensekvens. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Histopatologiske træk ved leversygdom ved alfa 1-antitrypsinmangel. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Denaturerende gradientgelelektroforese af alfa 1-antitrypsin-genet: anvendelse til prænatal diagnose. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Serumkoncentrationer af enzymhæmmere i forbindelse med respiratorisk distress-syndrom. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Hepatisk morfologi i arvelige metaboliske sygdomme. Sem Liver Dis 1986;6;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Tildeling af alfa 1-antitrypsin-genet og et sekvensrelateret gen til det menneskelige kromosom 14 ved molekylær hybridisering. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. Det elektroforiske alfa-1-globulinmønster i serum ved alfa-1-antitrypsinmangel. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Effekt af administration af et kombineret strogen-progestin præventionsmiddel på niveauet af individuelle plasmaproteiner. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alpha 1-antitrypsin: molekylært og Pi-systemet. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Hurtig ikke-radioaktiv påvisning af mutationer i det menneskelige genom ved allelspecifik amplifikation. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Kliniske manifestationer af alfa 1-antitrypsinmangel. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S e Z do gene da alfa-1-antitripsina em um grupo de pacientes portadores de doença pulmonar crônica . Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Alpha-1-antitrypsinmangel. Høj prævalens i St. Louis-området konstateret ved direkte screening af befolkningen. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Leversygdom ved alfa 1-antitrypsinmangel påvist ved screening af 200.000 spædbørn. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. The natural history of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficient children. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Leversygdom hos spædbørn. Histologiske træk og relation til alfa 1-antitrypsin-fænotype. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Human plasma proteinaseinhibitorer. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Alpha 1-antitrypsinmangel: en oversigt. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Manglende erstatningsbehandling i forbindelse med emfysem. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Undersøgelse udført af afdelingerne for pædiatri, medicinsk genetik, anatomisk patologi og klinisk patologi på fakultetet for medicinske videnskaber (FCM), statsuniversitetet i Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brasilien.

1 Postgraduate studerende. Afdeling for pædiatri, FCM/UNICAMP.

2 Assistentprofessor. Afdeling for klinisk patologi, FCM/UNICAMP.

3 Assistentprofessor. Afdeling for anatomisk patologi, FCM/UNICAMP.

4 Ph.d. i genetik (Institut for Biologi), UNICAMP.

5 Adjunkt. Afdeling for medicinsk genetik, FCM/UNICAMP.

6 Adjunkt. Afdeling for pædiatri, FCM/UNICAMP.