- Abstrakt
- 1. Indledning
- 2. Materialer og metoder
- 2.1. Organismer og dyrkningsbetingelser
- 2.2. Fremstilling af svampeekstrakter
- 2.3. Genoprotektiv aktivitet
- 2.3.1. Forsøgspersoner
- 2.3.2. Undersøgelsesdesign
- 2.3.3.3. Single Cell Gel Electrophoresis Assay
- 2.4. Antioxidativ aktivitet
- 2.4.1. DPPH- Assay
- 2.4.2. Bestemmelse af det samlede phenolindhold
- 2.4.3. Bestemmelse af det samlede flavonoidindhold
- 2.5. Statistisk analyse
- 3. Resultater og diskussion
- 3.1. Ekstraktionsudbytte
- 3.2. Genoprotektiv aktivitet
- 3.3. Antioxidant aktivitet
- 4. Konklusion
- Interessekonflikter
- Akkreditering
Abstrakt
Trametes-arter har været anvendt i tusindvis af år i traditionel og konventionel medicin til behandling af forskellige typer sygdomme. Målet var at evaluere mulige antigenotoksiske virkninger af mycelium- og basidiocarpekstrakter af udvalgte Trametes-arter og at vurdere afhængigheden af deres antioxidantpotentiale. De undersøgte arter var Trametes versicolor, T. hirsuta og T. gibbosa. Ekstrakternes antigenotoksiske potentiale blev vurderet på humane perifere hvide blodlegemer med basidiocarp- og myceliumekstrakter af arterne. Den alkaliske komet-test blev anvendt til påvisning af DNA-strengebrud og alkali-labile steder samt omfanget af DNA-migration. DPPH-analysen blev anvendt til at vurdere ekstrakternes antioxidative egenskaber. Frugtlegemeekstrakter af T. versicolor og T. gibbosa samt T. hirsuta-ekstrakter, bortset fra 20,0 mg/mL, var ikke genotoksiske stoffer. T. versicolor-ekstrakt havde ved 5,0 mg/mL den største antigenotoksiske virkning ved både før- og efterbehandling af leukocytter. Myceliumekstrakterne af de tre arter havde ingen genotoksisk aktivitet og en betydelig antigenotoksisk virkning mod H2O2-induceret DNA-skade, både før og efter behandling. Resultaterne tyder på, at ekstrakter af disse tre arter kan betragtes som stærke antigenotoksiske stoffer, der er i stand til at stimulere cellernes genopbeskyttende respons.
1. Indledning
Svampe har længe været anvendt som en fødevare, men også i traditionel medicin i både den vestlige og østlige verden . Selv om mange svampe er anerkendt som sunde fødevarer , er deres store farmakologiske potentiale stadig underudnyttet . Næsten 60 Trametes-arter er kendt i verden, men kun nogle få af dem er undersøgt for deres medicinske egenskaber . Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd er den mest berømte medicinske art fra slægten. Denne art, hvis folkelige navne er Turkey Tail i vestlige kulturer, Yun-Zhi (skylignende svamp) i Kina eller Kawaratake (svamp ved flodbredden) i Japan, har været anvendt i tusindvis af år i traditionel medicin, især i Asien . Ifølge Compendium of Chinese Materia Medica, der blev skrevet under Ming-dynastiet, er der registreret mere end 120 stammer af T. versicolor, og i traditionel kinesisk lægepraksis anses denne svamp for at være nyttig til at fjerne toksiner, styrke, øge energien, forbedre lever- og miltfunktionen og styrke immunforsvaret, især når den tørres, males og tilberedes til te . Alle disse egenskaber blev i folkemedicinen anset for at være meget nyttige ved kronisk brug af Trametes spp. præparater . I den konventionelle medicin anvendes arten hovedsagelig til behandling af forskellige typer kræft, men også til kronisk hepatitis, reumatoid arthritis og infektioner i luftvejene, urinvejene og fordøjelseskanalerne, hvilket blev bekræftet af talrige undersøgelser . Desuden er der rapporteret om stærke antivirale virkninger af nogle polysaccharopeptider isoleret fra T. versicolor og betydelig antioxidant aktivitet af Trametes spp. frugtlegemeekstrakter . Disse virkninger er hovedsagelig baseret på produktion af polysaccharidet krestin (PSK) og forskellige polysaccharid-peptidkomplekser, forbindelser, der reducerer kræftmetastaser og stimulerer produktionen af interleukin-1 i menneskelige celler .
Den rigelige tilstedeværelse af frie radikaler i miljøet er forbundet med forekomsten af oxidativ stress, som er et grundlag for aldring og initieringen og udviklingen af forskellige sygdomme og lidelser, som en stor del af verdens befolkning lider og dør af . DNA er mere følsomt over for oxidative skader end andre makromolekyler. DNA-skader, som f.eks. brud på DNA-strengen, kan fremkaldes af forskellige stoffer, hvoraf H2O2 har en genotoksisk virkning. Det er kendt, at disse skader kan påvirke immunforsvaret, ikke kun i forbindelse med inflammatoriske sygdomme, men også i forbindelse med kræft. Comet-testen er en veletableret og effektiv test med høj følsomhed, der er blevet anvendt til at undersøge DNA-skader og kan anvendes til at vurdere det genotoksiske og beskyttende potentiale af flere naturprodukter .
En genopbeskyttende aktivitet af svampeekstrakter baseret på reduktion af oxidative skader på DNA kan også spille en væsentlig rolle i forebyggelse og behandling af flere af de nævnte sygdomme og lidelser, men meget få undersøgelser har indtil nu betragtet det som et muligt virkemiddel i forskellige terapier . Målet med undersøgelsen var derfor at evaluere de antigenotoksiske virkninger af mycel- og basidiocarpekstrakter af udvalgte Trametes-arter på humane perifere hvide blodlegemer og at vurdere afhængigheden af deres antioxidantpotentiale.
2. Materialer og metoder
2.1. Organismer og dyrkningsbetingelser
Kulturer af Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301 og T. gibbosa BEOFB 310 blev isoleret fra frugtlegemer indsamlet fra Serbien og opbevaret på maltagarmedium i kultursamlingen på Institut for Botanik, Det Biologiske Fakultet, Beograds Universitet (BEOFB).
Inokulummet blev fremstillet ved inokulering af 100,0 mL syntetisk medium (glukose, 10.0 g L-1; NH4NO3, 2,0 g L-1; K2HPO4, 1,0 g L-1; , 0,4 g L-1; , 0,5 g L-1; gærekstrakt, 2,0 g L-1; pH 6,5) med 25 mycelialskiver (Ø 0.5 cm, fra 7 dage gammel kultur fra maltagar) i 250 mL kolber og inkubation på en roterende shaker ved 100 rpm, ved stuetemperatur (°C) i 7 d. Den resulterende biomasse blev vasket og homogeniseret med 100,0 mL sterilt destilleret vand (dH2O) i en laboratoriemixer. Den homogeniserede biomasse (30,0 mL) blev anvendt til inokulering af 500,0 mL modificeret syntetisk medium (med glukose på 65,0 g L-1). Dyrkning under vand blev udført i 1000 mL kolber ved stuetemperatur på en roterende omryster i 21 d. Den opnåede biomasse blev filtreret, vasket 3 gange med dH2O på en magnetomrører og tørret ved 50 °C til konstant vægt.
2.2. Fremstilling af svampeekstrakter
Tørret frugtlegeme og mycelium (3,0 g) blev ekstraheret ved omrøring med 90,0 mL 96% ethanol ved 30°C i 72 timer. De resulterende ekstrakter blev centrifugeret (20°C, 3000 rpm, 15 min), og supernatanterne blev filtreret gennem Whatman filterpapir nummer 4, koncentreret under reduceret tryk i en roterende fordamper (BÜCHI R-114, Schweiz) ved 40°C til tørhed og genopløst i 96% ethanol til antioxidantbestemmelse eller vand til antigenotoksisk bestemmelse til en indledende koncentration på 20,0 mg mL-1. Ekstraktionsudbyttet blev udtrykt som procent på tørstofbasis.
2.3. Genoprotektiv aktivitet
2.3.1. Forsøgspersoner
Hepariniserede fuldblodsprøver blev udtaget ved venepunktur fra tre raske donorer i alderen under 25 år. Deltagerne i undersøgelsen var ikke-rygere og ikke-alkoholikere, der ikke modtog nogen terapi eller medicin og ikke tog kosttilskud.
2.3.2. Undersøgelsesdesign
Genotoksicitet af alle ekstrakter og koncentrationer (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625 og 0,312 mg mL-1) blev undersøgt ved behandling af humane perifere hvide blodlegemer ved 37 °C i 30 minutter med det formål at evaluere DNA-skader. Normalt anvendes hvide blodlegemer, fordi de opnås på en forholdsvis ikke-invasiv måde, ikke kræver opdeling af væv og opfører sig godt i kometforsøget . Behandling med fosfatbufferet saltvand (PBS) ved 37 °C i 30 min blev anvendt som en positiv kontrol og behandling med 25,0 μM H2O2 på is i 15 min som en negativ kontrol.
To uafhængige protokoller blev anvendt til at vurdere ekstrakternes antigenotoksiske potentiale ved hjælp af for- og efterbehandling med ekstrakterne. Ved forbehandlingen blev cellerne inkuberet med ekstrakterne ved 37 °C i 30 minutter, hvorefter de blev vasket med PBS og udsat for H2O2 i 15 minutter. Ved efterbehandling blev cellerne behandlet med H2O2 på is i 15 minutter, skyllet med PBS og derefter behandlet med de syv ekstraktkoncentrationer ved 37 °C i 30 minutter. Efter hver behandling blev cellerne skyllet med PBS. Inkubation med PBS ved 37°C i 30 min var den negative kontrol, og behandling med 25,0 μM H2O2 på is i 15 min repræsenterede den positive kontrol.
Tre gentagelser blev udført for hvert eksperiment, og 100 kerner blev analyseret for hvert.
2.3.3.3. Single Cell Gel Electrophoresis Assay
Kometassayet blev udført som beskrevet af Singh et al. . Den alkaliske comet-test er i stand til at påvise DNA-strengbrud og alkali-labile steder, og omfanget af DNA-migration indikerer graden af DNA-skader i celler.
Hele blodprøver (6,0 μL) blev suspenderet i 0,67 % agarose med lavt smeltepunkt (LMP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og pipetteret på superfrostede glasmikroskopglasglasprøver, der er forbehandlet med et lag af 1% agarose med normalt smeltepunkt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), spredt ved hjælp af et dækglas og holdt på is i 5 min for at størkne. Efter forsigtigt at have fjernet dækglassene blev cellesuspensionerne på objektglassene behandlet med ekstrakterne og H2O2 som beskrevet ovenfor. Efter behandlingerne blev alle objektglasene dækket med det tredje lag 0,5 % LMP-agarose, og igen fik de lov til at størkne på is i 5 minutter. Efter fjernelse af dækglassene blev objektglassene anbragt i kold lyseringsopløsning (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100 og 10% dimethylsulfoxid, pH 10,0 justeret med NaOH) ved 4°C natten over, hvorefter de blev underkastet elektroforese og farvning med ethidiumbromid . Kometerne blev observeret og analyseret ved hjælp af et Olympus ×50-mikroskop (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Tyskland), der var udstyret med en anordning til registrering af fluorescens ved 100x forstørrelse. Vurdering af DNA-skader blev udført som beskrevet af Anderson et al. . Cellerne blev nemlig inddelt efter øjemål i fem kategorier svarende til følgende mængder DNA i halen: (A) ingen skade, <5%; (B) skade på lavt niveau, 5-20%; (C) skade på medium niveau, 20-40%; (D) skade på højt niveau, 40-95%; (E) total skade, >95% (figur 1). Analysen blev udført på 100 tilfældigt udvalgte celler pr. forsøgsperson (50 celler fra hvert af 2 gentagne objektglas). For at opnå en semikvantitativ analyse af data blev DNA-skader karakteriseret som DNA-migration over 5 % (B + C + D + E kometklasser).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
2.4. Antioxidativ aktivitet
2.4.1. DPPH- Assay
Antioxidant aktivitet blev defineret ved at måle blegning af den purpurfarvede methanolopløsning af det stabile 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradikal () . Scavenging-effekten blev målt spektrofotometrisk (CECIL CE 2501) ved 517 nm og beregnet ved hjælp af ligningen: hvor er absorbansen af den negative kontrol (reaktionsblanding uden ekstrakt) og er absorbansen af reaktionsblandingen.
Ekstraktkoncentration (mg ekstrakt/mL), der giver 50 % reduktion (EC50), blev opnået ved interpolation fra lineær regressionsanalyse. Alle målinger blev udført i tre eksemplarer med henblik på statistisk analyse. Kommercielt antioxidant, butylhydroxyanisol (BHA), i et koncentrationsområde på 20,0 mg mL-1-0,02 mg mL-1, blev anvendt som positiv kontrol.
2.4.2. Bestemmelse af det samlede phenolindhold
De samlede phenolforbindelser i mycelekstrakterne blev estimeret med Folin-Ciocalteu-reagenset efter metoden af Singleton og Rossi , idet gallicsyre blev anvendt som standard. Koncentrationen blev bestemt som μg gallicsyreækvivalenter (GAE) pr. mg tørstofekstrakt ved hjælp af en ligning, der blev beregnet på grundlag af en standardgallicsyrekurve som
2.4.3. Bestemmelse af det samlede flavonoidindhold
Det samlede flavonoidindhold blev bestemt efter metoderne af Park et al. med quercetin som standard. Mængden blev udtrykt som μg quercetinækvivalenter (QE) pr. mg tørstofekstrakt ved hjælp af en ligning opnået fra en standardquercetinhydratdiagram som
2.5. Statistisk analyse
Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± standardfejl af data opnået ved tre parallelle målinger. Envejsanalyse af varians (ANOVA) blev udført ved hjælp af STATISTIKA-software, version 5.0 (StatSoft Inc.) for at teste eventuelle signifikante forskelle. værdier mindre end 0,01 blev betragtet som statistisk signifikante. Den statistiske analyse af data fra comet-assayet blev udført ved χ2-test ved hjælp af Statgraph 4.2-software. For at udføre χ2-testen blev resultaterne fra de tre eksperimenter samlet, og vi evaluerede det samlede antal celler med DNA-skader. En forskel på blev betragtet som statistisk signifikant.
3. Resultater og diskussion
3.1. Ekstraktionsudbytte
Ekstraktionsudbyttet af myceliumbiomasse for alle tre arter var signifikant højere sammenlignet med frugtlegemet (). T. gibbosa havde det højeste ekstraktionsudbytte fra tørret mycelbiomasse (34,6 %) og det laveste udbytte fra tørrede frugtlegemer (2,2 %). Det højeste ekstraktionsudbytte af frugtlegemer på 6,67 % blev fundet hos T. versicolor, hvis myceliumekstraktionsudbytte var 8,0 %. Udbyttet i T. hirsuta var 12,0 % (for mycelium) og 2,85 % (for frugtlegemer). Forskellene i ekstraktionseffektivitet mellem arterne, både for mycelium og frugtlegeme, var statistisk signifikante ().
Forrige rapporter viste afhængigheden af biomasseekstraktionsevnen af art, stamme og opløsningsmiddel . Således fandt Ren et al., at ekstraktionsudbyttet af T. gibbosa basidiocarp var 1,22% for petroleumsetherekstrakt, 6,44% for ethylacetat og 9,2% for methanolekstrakter. Methanol var også et godt opløsningsmiddel for T. versicolor basidiocarp, hvis udbytte varierede mellem 4,1 % og 9,16 % . På baggrund af vores resultater kan det konkluderes, at alkoholer er de bedste opløsningsmidler, men at ethanol er svagere end methanol.
3.2. Genoprotektiv aktivitet
Da alle bloddonorer var ved godt helbred og havde samme alder og ikke var under nogen medicinering, viste den statistiske analyse ingen klare forskelle i deres reaktioner på ekstrakterne. Derfor blev resultaterne fra de tre eksperimenter samlet. Behandling af perifere blodleukocytter med H2O2 forårsagede en hurtig og kraftig induktion af enkeltstrengsbrud i kerne-DNA’et, hvilket var synligt i kometassayet som DNA-migration.
Vores resultater viste, at T. versicolor frugtlegemeekstrakter fra 0,312 til 20.0 mg mL-1 forårsagede ingen signifikant stigning i det samlede antal DNA-beskadigede celler sammenlignet med den positive kontrol, hvilket klart viser, at det testede ekstrakt ikke var et genotoksisk middel (figur 2(a) (A)). Fordelingen (værdien) af den samlede DNA-skade var også den samme som i den positive kontrol. På den anden side viste disse ekstrakter beskyttende virkninger mod H2O2 både før og efter behandling af leukocytter (figur 2(a) (B, C)). Ekstraktet ved 5,0 mg mL-1 havde den største effekt og ved 20,0 mg mL-1 den laveste effekt i begge behandlinger. Værdien af den samlede DNA-skade faldt statistisk set i forhold til den positive kontrol i alle koncentrationer ().
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
T. hirsuta frugtlegemeekstrakt ved alle koncentrationer undtagen 20,0 mg mL-1 viste ingen genotoksisk aktivitet, da niveauet af samlede DNA-skader ikke var statistisk set højere end i den positive kontrol (figur 2(b) (A)). Ved en koncentration på 20,0 mg mL-1 var den genotoksiske virkning og den samlede DNA-skade i cellerne imidlertid statistisk forskellig fra den positive kontrol. I for- og efterbehandlinger af leukocytter udviste ekstraktet ved alle koncentrationer undtagen den højeste en beskyttende virkning mod H2O2-induceret DNA-skade, idet det viste et signifikant fald i den samlede DNA-skade sammenlignet med den positive kontrol (figur 2(b) (B, C)). Disse behandlinger udviste en dosisafhængig korrelation, med den største beskyttende effekt ved en ekstraktkoncentration på 0,312 mg mL-1 , mens koncentrationen på 20 mg mL-1 ikke viste nogen beskyttelse mod kometer induceret af H2O2.
Den manglende genotoksiske såvel som signifikante antigenotoksiske effekt, dvs. reduktion af DNA-skader induceret af H2O2, i både før- og efterbehandling, blev også bemærket for T. gibbosa frugtlegemeekstrakt ved de syv koncentrationer (Figur 2(c)). I modsætning til T. hirsuta-ekstrakterne blev der imidlertid ikke observeret et dosisafhængigt respons i T. gibbosa basidiocarp-ekstrakterne; et gradvist fald i ekstraktkoncentrationen svarede nemlig ikke til en proportional reduktion af H2O2-induceret genotoksicitet.
Myceliumekstrakterne af T. versicolor, T. hirsuta og T. gibbosa havde ved alle analyserede koncentrationer ingen genotoksisk aktivitet (figur 3(a) (A), 3(b) (A) og 3(c) (A)). Alle myceliumekstrakter og koncentrationer viste en signifikant antigenotoksisk virkning mod H2O2-induceret DNA-skade, både før og efter behandlingen, og disse aktiviteter var ikke markant forskellige. I T. versicolor blev der konstateret en lidt lavere aktivitet ved den laveste ekstraktkoncentration. I T. hirsuta var koncentrationer på 5,0, 2,5 og 20,0 mg mL-1 mere effektive, mens der i T. gibbosa blev observeret den største beskyttende effekt ved en koncentration på 2,5 mg mL-1 og den laveste ved 20,0 mg mL-1 (figur 3(a) (B, C), 3(b) (B, C) og 3(c) (B, C)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Numre mutagene og kræftfremkaldende forbindelser er til stede i forskellige naturlige kilder . På den anden side kan nogle naturforbindelser enten være prooxidanter, der forårsager genotoksiske og/eller cytotoksiske virkninger, eller antioxidanter, afhængigt af koncentrationen og eksponeringens varighed . Svampearter med høj ernæringsmæssig og medicinsk værdi kan have forskellige in vitro- og in vivo-virkninger enten på grund af deres ustabilitet under fordøjelsesbetingelser eller manglende evne til at blive absorberet af mave-tarmkanalen . Aktiviteter, der er opnået in vitro, svarer ikke nødvendigvis til dem, der er fundet in vivo. Det er også vigtigt at understrege, at genotoksiske og antigenotoksiske virkninger af svampeekstrakter afhænger af arten, koncentrationen og den test, der anvendes til at vurdere dem . Vores resultater viste således, at de tre Trametes-arter har forskellig evne til at reducere H2O2-inducerede DNA-skader; f.eks. blev den laveste aktivitet konstateret i frugtlegemeekstrakt af T. hirsuta. Et klart omvendt dosis-respons-forhold mellem niveauet af DNA-skader og ekstraktkoncentrationen blev kun konstateret i T. hirsuta basidiocarp-ekstrakt. I T. versicolor og T. gibbosa førte en forøgelse af ekstraktkoncentrationen over den optimale dosis imidlertid ikke til nogen forbedring af kometresultaterne, hvilket bekræfter Miyaji et al.s resultater. Disse forfattere viste, at der ikke var nogen dosis-respons-sammenhæng mellem Lentinus edodes-ekstraktkoncentrationer og deres antigenotoksiske virkning. Det er vigtigt at nævne, at kombinerede phenol-, flavonoid- og andre ingredienser i ekstrakter bør have et større potentiale end de enkelte komponenter i ekstrakterne, hvilket indikerer betydningen af samspillet mellem alle ingredienserne . Dette resultat kan resultere i en anden tendens i Trametes spp. antigenotoksiske aktivitet. Morales et al. påviste, at ekstraktens genotoksiske aktivitet afhænger af testtypen; de rapporterede således, at basidiocarpekstrakter af Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus og Pleurotus ostreatus ikke havde nogen mutagen virkning på pattedyrceller ved hjælp af Ames Salmonella/mikrosom-testen. Der blev dog opnået en svag aktivitet af P. ostreatus-ekstrakt ved hjælp af CHO/HPRT-assayet.
De underliggende mekanismer for den antigenotoksiske virkning af svampeekstrakter er stadig ikke helt kendt. De beskyttende virkninger af ekstrakterne synes at være baseret på mere end én virkningsmekanisme, hvilket ikke er ualmindeligt for svampe ifølge Gebhart . Antigenotoksicitetsmekanismerne kunne evalueres ved anvendelse af for- og efterbehandlinger, dvs. forskellige kombinationer af ekstrakter og H2O2. Vores positive resultater i begge behandlinger viser, at ekstrakterne har beskyttende virkninger både på forebyggelses- og interventionsniveau og kan virke som desmutagener og bioantimutagener, hvilket også er påvist i tidligere undersøgelser . Effektiviteten af forbehandlingen, der blev konstateret i denne undersøgelse, kunne forklares ved at øge cellernes antioxidantkapacitet, dvs. stimulere syntesen og aktiviteten af antioxidantenzymer under induktion af oxidativt stress . Den positive effekt af efterbehandlingen kunne være resultatet af en synergistisk virkning af interventionelle aktiviteter via fjernelse af frie radikaler og stimulering af antioxidante enzymer samt stimulering af DNA-reparation, som foreslået af Chiaramonte et al. Da disse forfattere rapporterede om en betydelig reparation af DNA-skader efter 30-60 minutters eksponering for et oxidativt middel, kunne det konkluderes, at DNA-reparation spillede en mindre væsentlig rolle i beskyttelsen mod H2O2, da efterbehandlingsbetingelserne omfattede op til 30 minutters inkubation. Derfor er den genopbeskyttende aktivitet af Trametes spp.-ekstrakterne sandsynligvis baseret på antioxidantvirkninger. På den anden side er det kendt, at eukaryote organismer har udviklet en signalvej, kaldet DNA-skadesrespons, til at beskytte mod genomiske krænkelser. Gasser og Raulet påviste, at DNA-skadesresponset alarmerer immunsystemet ved at fremkalde ekspression af celleoverfladeligander for den aktiverende immunreceptor NKG2D, som udtrykkes af naturlige dræberceller (NK-celler) og visse T-celler. Derfor kan den genopbeskyttende aktivitet af Trametes spp. i celler, der udsættes for genotoksiske stoffer, modulere DNA-skadesresponset og fungere som en barriere i den tidlige tumorigenese. De yderligere undersøgelser bør omfatte analyse af superoxiddismutase- og katalase-niveauerne i lymfocytter, der er behandlet med Trametes spp.-ekstrakter, både før og efter behandling med H2O2, for at bekræfte antagelsen om, at en forbedring af antioxidantkapaciteten i cellerne induceres af disse ekstrakter.
3.3. Antioxidant aktivitet
De testede ethanolekstrakter var gode antioxidanter, men deres aktivitet var afhængig af arten. Frugtlegemeekstrakter viste signifikant højere scavenging-effekter end myceliumekstrakter (). Den højeste DPPH-radikalafdræbende aktivitet blev påvist i T. versicolor-ekstrakter, både frugtlegeme og mycelium (63,5 % og 59,4 %, hhv.), hvilket blev bekræftet af EC50-værdierne (15,22 mg mL-1 og 16,18 mg mL-1, hhv.). Der blev fundet et lidt lavere aktivitetsniveau for T. hirsuta-ekstrakter (59,0 % for basidiokarper og 46,8 % for mycelium), hvis koncentrationer på henholdsvis 17,06 mg mL-1 og 21,81 mg mL-1 gav en reduktion af radikalerne på 50 %. T. gibbosa var den art med det laveste scavengingpotentiale, især for myceliumekstrakter (39,7 %) med en EC50-værdi på 26,15 mg mL-1. Imidlertid var den radikalafbindende evne for frugtlegemeekstraktet ikke signifikant lavere i sammenligning med de to andre arter (53,7 % og EC50 på 18,13 mg mL-1). Den scavenging aktivitet af den syntetiske antioxidant BHA var 94,28%, og en koncentration på 0,10 mg mL-1 gav en reduktion på 50%.
Det samlede phenolindhold i frugtlegeme- og myceliumekstrakter af Trametes-arter var signifikant forskelligt () (Tabel 1). Generelt var phenolindholdet i frugtlegemeekstrakter højere end i myceliumekstrakter.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Både T. versicolor basidiocarp- og T. versicolor myceliumekstrakter var de rigeste med phenoler og flavonoider, mens de laveste koncentrationer blev målt i T. gibbosa-ekstrakter. I henhold til phenol- og flavonoidkoncentrationerne lå ekstrakter af T. hirsuta mellem de to andre arters ekstrakter (tabel 1). Graden af korrelation mellem ekstrakternes scavenging-aktivitet og phenol- og flavonoidindholdet var høj med for frugtlegemer på henholdsvis 0,98 og 0,99 og for mycelium på henholdsvis 0,97 og 0,99.
Tidligere undersøgelser har også indikeret Trametes-arternes antioxidantpotentiale . Således påviste Kamiyama et al. at en ekstraktkoncentration på blot 0,5 mg mL-1 fanger næsten 50 % af afhængig af opløsningsmidlet, mens Johnsy og Kaviyarasana noterede en reduktion på blot 91,5 % radikaler ved et methanolekstrakt af T. gibbosa basidiocarps ved en koncentration på 1,0 mg mL-1. Ethanolekstrakter testet i vores undersøgelse havde lidt lavere kapacitet, men højere end ethanol T. hirsuta frugtlegemeekstrakter analyseret af Sheikh et al. .
I henhold til Mau et al. og Palacios et al. spiller phenolforbindelser en nøglerolle i den antioxidative aktivitet. Disse forbindelser er meget rigelige og vigtige bestanddele af svampes frugtlegemer og mycelier. Deres evne er baseret på tilstedeværelsen af hydroxylgrupper, der fungerer som reduktionsmidler, metalchelatorer, singlet oxygen quenchers og hydrogendonorer . I nogle tilfælde kunne deres aktivitet imidlertid ikke tilskrives det samlede phenolindhold i ekstrakterne, hvilket bekræftes af en sammenligning af vores resultater med Johnsy og Kaviyarasanas resultater . Nemlig blev 91,5 % af reduceret af T. gibbosa basidiocarp ekstrakt indeholdende 23,8 μg GAE mg-1 ekstrakt, mens et ekstrakt af stamme BEOFB 310 med en phenolkoncentration på 20,07 μg GAE mg-1 ekstrakt kun fik fjernet 63,5 % radikaler. Koncentrationen af flavonoider i den serbiske T. gibbosa-stamme var imidlertid betydeligt højere sammenlignet med den stamme, der blev testet af Johnsy og Kaviyarasana (henholdsvis 7,63 μg QE mg-1 ekstrakt og 0,59 μg QE mg-1 ekstrakt), og dette kunne forklares med opløsningsmidlernes forskellige polariteter samt forskellige stammers kapacitet til flavonoidsyntese .
4. Konklusion
Undersøgelsen var det første forsøg på at vurdere den DNA-beskyttende aktivitet af T. versicolor-, T. hirsuta- og T. gibbosa-ekstrakter og fastslår, om denne var baseret på deres antioxidantpotentiale. Resultaterne tyder på, at ekstrakter af disse tre arter kan betragtes som stærke antigenotoksiske midler, der er i stand til at stimulere genopbeskyttende respons af celler, der bidrager til forbedret immunfunktion, fjernelse af toksiner og styrkelse, hvilket refererer til den traditionelle anvendelse. Det er dog nødvendigt med yderligere undersøgelser for at afsløre specifikke bærere af den antigenotoksiske aktivitet og den måde, hvorpå DNA beskyttes mod oxidativ skade.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter vedrørende offentliggørelsen af denne artikel.
Akkreditering
Forfatterne takker professor Dr. Steve Quarrie, gæsteprofessor ved University of Newcastle, Storbritannien, for at revidere og forbedre engelsk. Denne undersøgelse blev gennemført med finansiel støtte fra Republikken Serbiens ministerium for uddannelse, videnskab og teknologisk udvikling, projekt nr. 173032 og projekt nr. 173034.
Skriv et svar